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Eliminaci�n de biopeliculas mediante antimicrobianos naturales en superficies de proceso en la industria alimentaria

 

Elimination of biofilms by natural antimicrobials on process surfaces in the food industry

 

Remo��o de biofilme por antimicrobianos naturais em superf�cies de processo na ind�stria de alimentos

 

Cristian Jos� Esparza-Bonilla ^I

cristianjoss_590@hotmail.com

https://orcid.org/0000-0001-6757-3952

 

Byron Leoncio D�az-Monroy ^II

bdiaz@espoch.edu.ec

https://orcid.org/0000-0003-3721-7994

 

Ronald Henry D�az-Arrieta ^III

diazronald5896@gmail.com

https://orcid.org/0000-0003-4566-8437

 

Correspondencia: cristianjoss_590@hotmail.com

Ciencias Naturales

Art�culo de investigaci�n

 

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*Recibido: 20 de diciembre de 2020 *Aceptado: 12 de enero de 2021 * Publicado: 08 de febrero de 2021

 

       I.            Master Universitario en Ciencia, Seguridad y Tecnolog�a de los Alimentos, Ingeniero en Industrias Pecuarias, Profesor Ocasional de la Escuela Superior Polit�cnica de Chimborazo, Riobamba, Ecuador.

    II.            Doctor (PhD) en Ciencias Veterinarias,� Master en Biotecnolog�a, Ingeniero Zootecnista, Profesor Titular Principal de la Escuela Superior Polit�cnica de Chimborazo, Riobamba, Ecuador.

�III.            Ingeniero en Sistemas Inform�ticos, Candidato a M�ster Universitario en Ingenier�a de Software y Sistemas Inform�ticos de la UNIR, Espa�a, Ecuador.

Resumen

Las biopel�culas son organizaciones microbianas que se adhieren a las superficies de proceso de alimentos, son resistentes a desinfectantes, deterioran la maquinaria y contaminan los alimentos. En la Universidad de Zaragoza, se realiz� este estudio para evaluar la eliminaci�n In vitro de biopel�culas formadas por Escherichia coli MG1655 y Listeria monocytogenes EGD-e sobre superficies de poliestireno y acero inoxidable, mediante la aplicaci�n de aceites esenciales o sus constituyentes individuales: carvacrol, �xido de limoneno y aceite de naranja en dosis de 500 y 1000 ppm cada uno, as� como la influencia del pH (4,0 y 7,0). La formaci�n de la biopel�cula se estimul� mediante cultivos en placas de 24 pocillos de acero inoxidable (AISI 304 y AISI 316) y de poliestireno en estufas de aire est�tico, durante 72 horas a 37�C. Luego, los tres compuestos naturales se aplicaron directamente sobre las biopel�culas, mostrando distinto grado de eficacia para reducir el n�mero de c�lulas s�siles de las dos bacterias, as� el carvacrol en dosis de 1000 ppm, result� el m�s eficaz, con niveles de inactivaci�n microbiana superiores a 5 ciclos logar�tmicos en superficies de acero inoxidable AISI 304 y AISI 316, sin influencia del valor del pH evaluado. El estudio demostr� que las superficies de acero inoxidable favorecen la acci�n antimicrobiana del carvacrol en comparaci�n con las de poliestireno, lo cual contribuye a ratificar el uso del acero inoxidable como material id�neo para superficies de proceso en contacto con alimentos, adem�s de ofrecer una alternativa org�nica para desinfecci�n en la industria alimentaria.

Palabras claves: Industria alimentaria; acero inoxidable; biopel�cula; aceite esencial; carvacrol.

 

Abstract

Biofilms are microbial organizations that adhere to food processing surfaces, are resistant to disinfectants, deteriorate machinery and contaminate food. At the University of Zaragoza, this study was conducted to evaluate the in vitro elimination of biofilms formed by Escherichia coli MG1655 and Listeria monocytogenes EGD-e on polystyrene and stainless steel surfaces, by applying essential oils or their individual constituents: carvacrol, limonene oxide and orange oil in doses of 500 and 1000 ppm each, as well as the influence of pH (4.0 and 7.0). The formation of the biofilm was stimulated by cultures in plates of 24 stainless steel wells (AISI 304 and AISI 316) and polystyrene in static air stoves, for 72 hours at 37oC. The three natural compounds were then applied directly to the biofilms, showing different degree of effectiveness in reducing the number of sessile cells of the two bacteria, thus carvacrol at doses of 1000 ppm, proved the most effective, with microbial inactivation levels greater than 5 logarithmic cycles on AISI 304 and AISI 316 stainless steel surfaces, without influence on the value of the pH evaluated. The study showed that stainless steel surfaces favor the antimicrobial action of carvacrol compared to polystyrene, which helps ratify the use of stainless steel as an ideal material for food contact process surfaces, as well as offering an organic alternative to disinfection in the food industry.

Keywords: food industry; stainless steel; biofilm; essential oil; carvacrol.

 

Resumo

Biofilmes s�o organiza��es microbianas que aderem �s superf�cies de processamento de alimentos, s�o resistentes a desinfetantes, deterioram as m�quinas e contaminam os alimentos. Na Universidade de Zaragoza, este estudo foi realizado para avaliar a elimina��o in vitro de biofilmes formados por Escherichia coli MG1655 e Listeria monocytogenes EGD-e em superf�cies de poliestireno e a�o inoxid�vel, por meio da aplica��o de �leos essenciais ou seus constituintes individuais: carvacrol, �xido de limoneno e �leo de laranja nas doses de 500 e 1000 ppm cada, bem como a influ�ncia do pH (4,0 e 7,0). A forma��o do biofilme foi estimulada por meio de culturas em placas de 24 po�os de a�o inoxid�vel (AISI 304 e AISI 316) e de poliestireno em fornos de ar est�tico, por 72 horas a 37�C. Em seguida, os tr�s compostos naturais foram aplicados diretamente nos biofilmes, apresentando um grau de efic�cia diferente na redu��o do n�mero de c�lulas s�sseis das duas bact�rias, sendo o carvacrol em doses de 1000 ppm o mais eficaz, com maiores n�veis de inativa��o microbiana. em 5 ciclos logar�tmicos em superf�cies de a�o inoxid�vel AISI 304 e AISI 316, sem influ�ncia do valor de pH avaliado. O estudo mostrou que as superf�cies de a�o inoxid�vel favorecem a a��o antimicrobiana do carvacrol em rela��o ao poliestireno, o que contribui para ratificar a utiliza��o do a�o inoxid�vel como material ideal para superf�cies de processos em contato com alimentos, al�m de oferecer uma alternativa org�nica para desinfec��o em alimentos. Industria.

Palavras-chave: Ind�stria de alimentos; a�o inoxid�vel; biofilme; �leo essencial; carvacrol.

 

Introducci�n

La inocuidad, seg�n la Real Academia de la Lengua Espa�ola, se define como el car�cter de ser inocuo, es decir, que no cause da�o al consumidor. En este sentido, la salud p�blica se pone en riesgo cuando a lo largo de la cadena alimentaria no se siguen buenas pr�cticas de producci�n, procesamiento, conservaci�n, transporte y/o venta de alimentos (Nguyen-Viet, Tuyet-Hanh, Unger, Dang-Xuan, & Grace, 2017). Seg�n la Organizaci�n Mundial de la Salud (OMS, 2015), la inocuidad de los alimentos es una cuesti�n prioritaria para los consumidores, productores y gobiernos, y se�ala que invertir en salubridad de los alimentos significa invertir en la pr�xima generaci�n. Su importancia radica en que con frecuencia se producen brotes alimentarios vehiculizados por una amplia variedad de productos alimenticios (Jofr� et al., 2016). Estos brotes pueden estar causados por malas pr�cticas higi�nicas a lo largo de la cadena de producci�n, desde las pr�cticas agr�colas y\o ganaderas hasta las ejercitadas por los consumidores. Adem�s de suponer un riesgo para la salud del consumidor tambi�n tiene repercusi�n a nivel econ�mico, con interrupci�n del comercio nacional e internacional, como lo demostr� el grave brote con Escherichia coli O104:H4 en Alemania en 2011 (Asselt, Fels-Klerx,Breuer, & Helsloot, 2017).

Entre las bacterias pat�genas causantes de infecciones e intoxicaciones alimentarias destacan algunos serotipos de Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella ent�rica Typhimurium y Staphylococcus aureus (Duvenage, Duvenage, Plessis, Volschenk, & Korsten, 2017).

Seg�n estudios actuales, es conocido que las bacterias no se encuentran en el medio ambiente exclusivamente de forma libre, comport�ndose como seres unicelulares, sino que, en muchas ocasiones, pueden encontrarse formando parte de comunidades microbianas con un sistema de organizaci�n m�s t�pico de los organismos coloniales, creciendo adheridas a superficies y embebidas en matrices extracelulares que ellas mismas sintetizan, a estas estructuras biol�gicas se las denomina biopel�culas (Dom�nguez Rodr�guez, Badiola D�ez, Cepeda S�ez, M�s Bar�n, & Rodr�guez Ferri, 2010). Las biopel�culas se reconocen como un ecosistema microbiano unido a una superficie abi�tica y embebido dentro de sustancias polim�ricas extracelulares sintetizadas por las propias c�lulas. La formaci�n de biopel�culas bacterianas es una cuesti�n alarmante en la industria alimentaria debido a su elevada resistencia frente a antimicrobianos, calor y desinfectantes (Branda, Kolter, Chu, Kearns, & Losick, 2006). Las biopel�culas comparten una caracter�stica estructural importante; sus c�lulas constituyentes est�n unidas por una matriz extracelular que se compone principalmente de macromol�culas, incluyendo polisac�ridos, prote�nas, y �cidos nucleicos, que son producidas por las propias c�lulas. Adem�s, se ha demostrado que la matriz extracelular desempe�a un papel esencial en el establecimiento y mantenimiento de la estructura de las biopel�culas (Roux et al., 2015).

Las bacterias m�s comunes en formaci�n de biopel�culas son Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella ent�rica Typhimurium, Staphylococcus aureus y Cronobacter sakazakii (Bae, Baek, & Lee, 2012). Estas bacterias, poseen la capacidad de desarrollar biopel�culas y adherirse en la mayor�a de las superficies ampliamente utilizadas en el procesamiento de alimentos, incluyendo acero inoxidable, juntas de goma y pol�meros, y suponer una fuente de contaminaci�n cruzada para el alimento. Adem�s, se ha evidenciado que las biopel�culas desarrolladas en el procesado de alimentos de la industria poseen una mayor resistencia debido a la elevada cantidad de nutrientes disponibles, favoreciendo su crecimiento y diseminaci�n a lo largo de la cadena productiva (Kim & Kang, 2017).

En cuanto a los materiales para el contacto con alimentos en la industria son el acero inoxidable, vidrio, caucho, policarbonato, poliuretano, poliestireno, polipropileno, tefl�n, nitrilo, titanio, aluminio, cer�mica y madera. Es habitual que las biopel�culas puedan desarrollarse en cualquiera de estas superficies. La adhesi�n al sustrato depende de las propiedades fisicoqu�micas del sustrato tales como textura, hidrofobicidad y carga superficial (Pag�n & Garc�a-Gonzalo, 2016). El principal factor que promueve el proceso de formaci�n de biopel�culas es el envejecimiento de los materiales de contacto, lo que habitualmente se produce por la temperatura, la utilizaci�n, los agentes de limpieza, etc. (Storgards, Simola, Sj�berg, & Wirtanen, 1999).

El acero inoxidable posee una alta resistencia a la corrosi�n debido a sus altos contenidos de cromo y n�quel, sin embargo, en funci�n de su composici�n, pueden presentar diferentes propiedades mec�nicas y tribol�gicas (Biehler, Hoche, & Oechsner, 2017). AISI (American Iron and Steel Institute) 304 y AISI 316 son los aceros inoxidables m�s utilizados en la fabricaci�n de equipos para la industria alimentaria. AISI 304 es un acero con un m�nimo de 18% de cromo, 8% de n�quel y hasta 0,08% de carbono, mientras que AISI 316, es un acero que tiene hasta 3% de molibdeno y m�s alto contenido de n�quel (10-14%) que AISI 304. La principal diferencia entre los dos aceros, AISI 304 y AISI 316, es su contenido de molibdeno, a�adido para aumentar la resistencia a la corrosi�n en diversos ambientes (salmueras, blanqueo, biofluidos, etc.); concretamente el molibdeno reduce e inhibe la corrosi�n por picadura inducida por cloruros. A pesar de que el acero inoxidable AISI 316 posee mayor resistencia qu�mica, el acero inoxidable AISI tipo 304 ha sido el m�s ampliamente utilizado por los fabricantes de equipos para la industria alimenticia debido a su menor coste (Casarin, Casarin, Brandelli, et al., 2016). 

Para eliminar eficazmente los residuos que puedan contener microorganismos es fundamental la utilizaci�n de un m�todo de limpieza eficaz. Entre los m�todos de limpieza empleados, cabe destacar la aplicaci�n de fuerzas f�sicas y/o productos qu�micos tales como agentes tensoactivos o productos alcalinos, utilizados para suspender y disolver residuos alimentarios por disminuci�n de la tensi�n superficial. Entre los principales agentes antimicrobianos convencionales empleados en los sistemas de limpieza se encuentran el yodo, hipoclorito, �cido ani�nico, �cido peroxiac�tico y amonio cuaternario. As�, los procesos de limpieza normalmente pueden llegar a eliminar el 90% o m�s de los microorganismos asociados a las superficies de contacto, pero no siempre resulta posible lograr su total eliminaci�n. Si bien uno de los principales inconvenientes de una buen limpieza o desinfecci�n es a menudo el coste que implica el tiempo de inactividad de los equipos, la raz�n fundamental que nos obliga a revisar los sistemas de limpieza actuales es el alto grado de contaminaci�n y residuos que se genera por parte de los productos de limpieza empleados, lo que supone en ocasiones un grave riesgo para la salud humana y el medio ambiente (Sim�es, Sim�es, & Vieira, 2010). 

En la actualidad, como alternativa al uso de desinfectantes qu�micos tradicionales, se est� estudiando la eficacia de antimicrobianos de origen natural. Esto responde a la demanda de los consumidores por productos alimenticios m�s seguros, naturales y saludables, y al reciente crecimiento negativo y percepci�n de los consumidores contra los productos qu�micos sint�ticos, lo que se est� desplazando el esfuerzo de investigaci�n hacia alternativas naturales (Raffaella et al., 2017). En este sentido, la investigaci�n de nuevas sustancias en la desinfecci�n capaces de evitar la formaci�n de biopel�culas o causar su destrucci�n es un �rea de creciente inter�s. 

Seg�n Botta and Scaffaro (2010), se est� estudiando el uso de antimicrobianos naturales con el fin de remplazar a los agentes de limpieza tradicionales, entre los que se destacan los aceites esenciales (AEs) de especias y hierbas arom�ticas. Numerosos estudios han demostrado la eficacia de los componentes de los AEs en la eliminaci�n de las biopel�culas, pero hay que tener en cuenta que muy pocas veces se ha estudiado en profundidad en materiales com�nmente utilizados en la industria, como son los aceros (Dorman & Deans, 2000). Estos aceites esenciales (AEs) son comprobados antimicrobianos de origen vegetal, productos l�quidos arom�ticos que se extraen con procesos como la destilaci�n, la extrusi�n mec�nica o la extracci�n con solventes vol�tiles (Burt, 2004). En la naturaleza, sirven de protecci�n a las plantas que los sintetizan debido a sus propiedades antibacterianas, antivirales, antif�ngicas e insecticidas (Bakkali, Averbeck et al., 2008). Sus propiedades antimicrobianas residen en la gran variedad de compuestos terpenoides que los componen, como por ejemplo el carvacrol, compuesto monoterpenoide fen�lico del or�gano. Este compuesto tiene un elevado efecto antimicrobiano ya que provoca da�os estructurales y funcionales a la membrana celular, y la desintegraci�n de la membrana externa causando la liberaci�n de lipopolisac�ridos (LPS) en bacterias Gram-negativas. Aunque el carvacrol afecta a la membrana externa, se considera que la principal causa de su efecto antimicrobiano reside en el da�o producido en la membrana citoplasm�tica, de esta manera repercute en el transporte pasivo de iones a trav�s de ella (Hyldgaard, Mygind, & Meyer, 2012).

Por otra parte, los aceites c�tricos, y concretamente el obtenido de la naranja, se utilizan ampliamente en diversas aplicaciones en las industrias de los alimentos. Los aceites c�tricos son mezclas de m�s de cien compuestos que se pueden clasificar en tres fracciones: hidrocarburos terp�nicos, compuestos oxigenados y compuestos no vol�tiles. El �xido de limoneno se encuentra en muchos aceites esenciales de plantas y en especial de origen c�trico, como sucede en el aceite esencial de naranja. El �xido de limoneno es un terpeno producido a partir de la combinaci�n de varias unidades de isopreno (C₅ H₈) sintetizados en el citoplasma de las c�lulas vegetales de la corteza de los c�tricos (Caballero & Caballero, 2003). Los estudios realizados con �xido de limoneno han mostrado que su actividad antimicrobiana es moderada frente a 25 g�neros diferentes de bacterias que plantean problemas en los animales, plantas y productos alimenticios (Dorman & Deans, 2000). Los aceites esenciales y sus principales constituyentes son generalmente reconocidos como seguros (GRAS) (Fisher, Phillips, & McWatt, 2009).

En base a lo anteriormente expuesto, el objetivo fue estudiar In vitro la influencia de la superficie de contacto, acero inoxidable (AISI 304 y AISI 316) y pl�stico de laboratorio (Poliestireno), en la eliminaci�n de biopel�culas formadas por Escherichia coli MG1655 y Listeria monocytogenes EGD-e mediante la aplicaci�n de aceites esenciales o sus constituyentes individuales: carvacrol, �xido de limoneno y aceite de naranja, en concentraciones de 500 y 1000 ppm cada uno y bajo dos pH distintos: 7,0 y 4,0.

Materiales y m�todos

Preparaci�n de las biopel�culas

Para llevar a cabo la formaci�n de las biopel�culas se emplearon dos cepas bacterianas diferentes: L. monocytogenes EGD-e y E. coli MG1655. A partir de los crioviales, conservados a -80�C con glicerol, se realizaron siembras en estr�a en placas con TSA de forma semanal, para la obtenci�n de colonias aisladas a partir de la cuales se realizar�an los experimentos a largo del estudio. En primer lugar, se prepararon los precultivos microbianos; para ello, se inocul� una colonia, previamente aislada, en un tubo de ensayo con caldo de cultivo tripticasa de soja (TSB). Este tubo con TSB se incub� en agitaci�n a 37�C durante 12 horas. A continuaci�n, se inocul�, en una proporci�n 1:100, el precultivo en caldo de cultivo TSB est�ril, previamente preparado. A continuaci�n, se a�adi� 2 mL de la diluci�n en placas de microtitulaci�n de 24 pocillos de pl�stico (Poliestireno) (control), y de acero inoxidable (AISI 304 y AISI 316). Estas placas se incubaron a 37�C durante 72 horas en una estufa de aire est�tico.

Recuento del n�mero de microorganismos presentes en las biopel�culas.

Tras las 72 horas se elimin� el sobrenadante de los pocillos y se procedi� al lavado de la placa cuidadosamente con agua destilada, para eliminar los restos medio de cultivo. Una vez realizado el lavado, en cada pocillo de la placa se a�adieron 1,5 ml de agua de peptona (0,1%) con Tween 80 (diluci�n 1:100), a los cuales se les aplic� ultrasonidos durante diez minutos para lograr la disgregaci�n de la biopel�cula formada en la placa. Posteriormente, se llevaron a cabo diluciones seriadas en agua de peptona (0,1%) y se procedi� a la siembra de 100 μL en placas Petri por homogeneizaci�n en masa en medio de cultivo tripticasa de soja (TSA). Las placas inoculadas con L. monocytogenes EGD-e se incubaron durante 48 horas a 35�C, mientras que las de E. coli MG1655 se incubaron durante 24 horas a 35�C. Transcurrido el tiempo de incubaci�n, se realiz� el recuento de colonias mediante un contador autom�tico de colonias.

Tratamiento de destrucci�n de las biopel�culas con carvacrol, �xido de limoneno y aceite de naranja.

Para ejecutar los estudios de eliminaci�n de biopel�culas formadas por L. monocytogenes EGD-e y E. coli MG1655, se realiz� una revisi�n bibliogr�fica con el objetivo de seleccionar, de forma aproximada, las concentraciones de los antimicrobianos naturales para aplicar en los tratamientos de destrucci�n de las biopel�culas, para as� poder comparar con estudios previos los resultados obtenidos. Las concentraciones seleccionadas para este estudio fueron de 500 y 1000 ppm para los tres compuestos naturales: carvacrol, �xido de limoneno y aceite de naranja, en base previos estudios (Fernandez, 2015; Alfonso, 2016). As�, tras el lavado, y de forma paralela al recuento de c�lulas en la biopel�cula, se realiz� el tratamiento de eliminaci�n de las biopel�culas con los diferentes compuestos individuales (CIs; carvacrol y �xido de limoneno) y el aceite esencial (AE) de naranja. Seg�n Oussalah, Caillet, Saucier, & Lacroix (2007), el pH puede influir en la efectividad de los tratamientos, por ello se evaluaron dos valores: un neutro (7,0) y un �cido (4,0), a�adiendo a cada uno de los pocillos, donde se encontraban las biopel�culas, 2 mL de tamp�n McIlvaine a pH 4,0 y pH 7,0 con los CIs disueltos. Los CIs se aplicaron a una concentraci�n de 500 ppm y 1000 ppm para evaluar su acci�n individual. Se dej� actuar al antimicrobiano, en contacto con la biopel�cula, durante 60 minutos a una temperatura de 37�C. Transcurrido este tiempo, se realiz� el lavado de los pocillos, para realizar el posterior recuento en placa con el fin de determinar la cantidad de microorganismos eliminados de la biopel�cula.

An�lisis estad�stico de datos

Los datos para la cuantificaci�n de las biopel�culas se obtuvieron por triplicado en cada experimento, y en base a tres experimentos independientes. En las gr�ficas se muestran las medias y la desviaci�n est�ndar (sd) de todas las r�plicas.

Por otro lado, se emple� el t-test o an�lisis ANOVA para detectar diferencias estad�sticamente significativas entre los resultados. Complementariamente se realiz� un post test Tukey, mediante la herramienta GraphPadPRISM�. La significancia estad�stica de cada uno de ellos se consider� a p<0,05.

 

Resultados y discusi�n

En primer lugar, se determin� la concentraci�n inicial de c�lulas s�siles de las biopel�culas de L. monocytogenes EGD-e y E. coli MG1655 tras 72 horas de incubaci�n en una estufa de aire est�tico a 37�C en funci�n del material de contacto (Figura 1). Como se observa en la figura 1A, el recuento inicial de las biopel�culas de L. monocytogenes EGD-e crecidas en poliestireno fue aproximadamente 1 ciclo logar�tmico mayor (>10⁷ UFC/mL) que el obtenido en cualquiera de los dos aceros empleados (>10⁶ UFC/mL) (p <0,05). Si bien las diferencias fueron mucho m�s reducidas, tambi�n las biopel�culas de E. coli MG1655 (Figura 1B) alcanzaron mayores recuentos en poliestireno que en acero inoxidable (p <0,05). Por otra parte, a modo de control, se verific� que el tratamiento durante 60 minutos en ausencia de antimicrobianos, �nicamente en presencia del tamp�n, y un posterior lavado, eliminaba menos de 2 ciclos logar�tmicos de la poblaci�n microbiana inicial, no existiendo diferencias significativas (p <0,05) entre el tamp�n de pH 4,0 y el de pH 7,0 en ninguno de los materiales empleados. No obstante, a pesar de eliminar gran parte de la biopel�cula inicial, esta segu�a estando constituida por c�lulas viables, que podr�an constituir una posible fuente de contaminaci�n desde un punto de vista pr�ctico, por lo que segu�a siendo igualmente importante lograr un m�todo efectivo que permitiera lograr el mayor grado de destrucci�n posible. Los resultados que se muestran en las figuras 2, 3 y 4 con objeto ilustran la reducci�n del n�mero de c�lulas s�siles de L. monocytogenes EGD-e y E. coli MG1655 tras la aplicaci�n de carvacrol (Figura 2), �xido de limoneno (Figura 3) y aceite de naranja (Figura 4).

 

Figura 1: Recuentos microbianos (UFC/mL) de biopel�culas de Listeria monocytogenes EGD-e (A) y Escherichia coli MG1655 (B) desarrolladas en placas microtiter de poliestireno (■), AISI 304 (■) y AISI 316 (■) tras incubaci�n durante 72 h a 37�C (control), y tras posterior incubaci�n a 37�C durante 60 min en presencia de tamp�n de pH 4,0 (pH 4) o pH 7,0 (pH 7). Se muestra la media y la desviaci�n est�ndar (barras de error) de tres r�plicas independientes. La l�nea de puntos indica el l�mite de detecci�n de la t�cnica de recuento utilizada, las letras indican las diferencias significativas (p <0,05) entre materiales y sus respectivos pHs.

 

Carvacrol��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������

El carvacrol posiblemente afecte al plegamiento de las prote�nas de la membrana externa. Seg�n Burt (2004), la presencia de una concentraci�n sub-letal de carvacrol en el medio de crecimiento de E. coli provoc� una alteraci�n en el plegamiento de prote�nas y la inhibici�n de la s�ntesis de flagelina, que caus� el crecimiento de nuevas c�lulas sin flagelos. Adem�s, las c�lulas que pose�an flagelos mostraron una disminuci�n de la motilidad en presencia de carvacrol, lo que indica que este compuesto puede alterar el potencial de membrana, y de este modo, la fuerza motriz de protones necesaria para impulsar el movimiento flagelar y regular el transporte de nutrientes a trav�s de las envolturas celulares. Como se observa en la figura 2, en el caso de L. monocytogenes EGD-e (Figura 2A) la aplicaci�n de 500 ppm de carvacrol permiti� reducir en aproximadamente 2 ciclos logar�tmicos la poblaci�n de c�lulas s�siles crecidas en los pocillos de poliestireno, y en aproximadamente 3 ciclos logar�tmicos en los de AISI 304 y 316. Con lo que respecta a E. coli MG1655, tras la aplicaci�n de 500 ppm de carvacrol se obtuvieron unos resultados similares en cuanto al nivel de inactivaci�n en comparaci�n con las biopel�culas de L. monocytogenes EGD-e, y si bien se alcanz� una destrucci�n de la biopel�cula obtenida en AISI 316 sensiblemente mayor, no se observaron diferencias estad�sticamente significativas (p <0,05) entre los dos tipos de acero inoxidable ensayados. Estos resultados corroboran los obtenidos en un estudio previo sobre E. coli, en el que se lograban tambi�n reducciones cercanas a los 3 ciclos logar�tmicos tras 72 horas de incubaci�n en poliestireno (Bazargani & Rohloff, 2016). Al realizar el an�lisis estad�stico entre los materiales se observ� que existen diferencias significativas (p <0,05) entre el pl�stico y los dos aceros, pero no entre los propios aceros. �Como se observa en la Figura 2, el tratamiento de 1000 ppm de carvacrol frente a las biopel�culas de L. monocytogenes EGD-e y de E. coli MG1655 formados en pocillos de AISI 304 y 316, causaron una reducci�n microbiana de 5 ciclos logar�tmicos, sin embargo los valores de inactivaci�n en poliestireno fueron inferiores: 3 ciclos logar�tmicos. En relaci�n a los resultados obtenidos en poliestireno, estudios realizados tambi�n en este material obtuvieron resultados similares cuando trataron de destruir biopel�culas de E. coli MG1655 mediante la adici�n de carvacrol a concentraciones de 700 ppm (P�rez-Conesa, Cao, Chen, McLandsborough & Weiss, 2011; Rigotti et al., 2017). Por otra parte, estos resultados demuestran la importancia del material d�nde se adhiere y desarrolla la biopel�cula, en la efectividad de los tratamientos desinfectantes mediante carvacrol. Si bien los resultados obtenidos en poliestireno confirman resultados previos de nuestro grupo de investigaci�n (Fern�ndez, 2015), los obtenidos en acero muestran por primera vez que este material no solo dificulta la formaci�n de biopel�culas sino que adem�s, facilita el ataque de este compuesto antimicrobiano. En este sentido, el estudio demuestra que las diferencias qu�micas entre los dos AISI empleados no interferir�an en la resistencia de las biopel�culas de Listeria monocytogenes EGD-e y E. coli MG1655 al carvacrol.

 

Figura 2: Recuentos microbianos (UFC/mL) de biopel�culas de Listeria monocytogenes EGD-e (A) y Escherichia coli MG1655 (B) en placas microtiter de poliestireno (■), AISI 304 (■) y AISI 316 (■), tras incubaci�n a 37�C durante 60 min en presencia de 500 ppm de carvacrol a pH 4 (5004) o pH7 (5007) o 1000 ppm de carvacrol a pH 4 (10004) o pH 7 (10007). Como control se incluyen los resultados recogidos en la Figura 1. Se muestra la media y la desviaci�n est�ndar (barras de error) de tres r�plicas independientes. La l�nea de puntos indica el l�mite de detecci�n de la t�cnica de recuento utilizada, las letras indican las diferencias significativas (p <0,05) entre materiales y sus respectivos pHs.

 

�xido de limoneno

El tratamiento de �xido de limoneno frente a la biopel�cula formada por L. monocytogenes EGD-e, a una concentraci�n de 500 y 1000 ppm del compuesto, permiti� reducir hasta 2 ciclos logar�tmicos de la carga de c�lulas s�siles de las biopel�culas, independientemente del tipo de material de contacto empleado y tambi�n del pH del medio de tratamiento. No se observaron diferencias estad�sticamente significativas (p <0,05) en ning�n caso. Los resultados obtenidos en poliestireno confirman resultados previos del grupo de investigaci�n (Espina, Somolinos, Pag�n, & Garc�a-Gonzalo, 2010).

En lo que respecta a E. coli MG1655, el tratamiento de �xido de limoneno tan solo logr� una reducci�n microbiana de 1 ciclo logar�tmico en ambos pHs, independientemente de la concentraci�n utilizada, 500 o 1000 ppm, o del material de los pocillos, pl�stico o acero inoxidable (p <0,05) (Figura 3). Si bien los resultados obtenidos en poliestireno confirman resultados previos de nuestro grupo de investigaci�n (Fern�ndez, 2015), los obtenidos en acero muestran por primera vez que este material se comportar�a de modo similar al poliestireno, y que las diferencias qu�micas entre los dos AISI empleados no interferir�an en la resistencia de las biopel�culas de Listeria monocytogenes EGD-e y E. coli MG1655 al �xido de limoneno, en contraposici�n a lo observado anteriormente cuando el ataque se realiza con carvacrol, y en el que las biopel�culas formadas sobre acero son m�s sensibles que las crecidas sobre superficie de poliestireno.

 

Figura 3. Recuentos microbianos (UFC/mL) de biopel�culas de Listeria monocytogenes EGD-e (A) y Escherichia coli MG1655 (B) en placas microtiter de poliestireno (■), AISI 304 (■) y AISI 316 (■), tras incubaci�n a 37�C durante 60 min en presencia de 500 ppm de �xido de limoneno a pH 4 (5004) o pH7 (5007) o 1000 ppm de carvacrol a pH 4 (10004) o pH 7 (10007). Como control se incluyen los resultados recogidos en la Figura 1. Se muestra la media y la desviaci�n est�ndar (barras de error) de tres r�plicas independientes. La l�nea de puntos indica el l�mite de detecci�n de la t�cnica de recuento utilizada, las letras indican las diferencias significativas (p <0,05) entre materiales y sus respectivos pHs.

 

 

Aceite de naranja

Como muestra la figura 4, los resultados obtenidos con aceite de naranja son muy similares a los obtenidos con �xido de limoneno (Figura 6), es decir, se lograron alcanzar niveles moderados de destrucci�n de las biopel�culas (no se alcanzan los 5 ciclos de inactivaci�n deseados), independientemente del material empleado, la concentraci�n de antimicrobiano y el pH del medio de tratamiento (p <0,05). Los resultados obtenidos sobre biopel�culas crecidas en poliestireno confirman la escasa actividad antimicrobiana sobre biopel�culas del aceite de naranja descrita previamente (Sandasi, Leonard, & Viljoen, 2008).

As�, se puede concluir que tanto el aceite de naranja como uno de sus principales constituyentes, el �xido de limoneno, logran niveles similares de inactivaci�n microbiana, aunque insuficientes a las concentraciones ensayadas, si lo que se pretende es alcanzar una destrucci�n superior a los 5 ciclos logar�tmicos de las c�lulas s�siles. Para lograr ese nivel �ptimo de destrucci�n, se hace preciso emplear carvacrol a la mayor concentraci�n testada (1000 ppm), aunque solo sobre superficies de acero, que probablemente por su mayor porosidad, disminuyen la resistencia de las biopel�culas frente a este agente antimicrobiano. Estos resultados confirmar�an la idoneidad del acero inoxidable como material de contacto con alimentos de referencia para la industria alimentaria. Para la destrucci�n de biopel�culas crecidas en poliestireno se requerir�a o bien una mayor concentraci�n de carvacrol, o el incremento de la temperatura de tratamiento hasta temperaturas moderadas de 45�C (Alfonso, 2016).

 

Figura 4: Recuentos microbianos (UFC/mL) de biopel�culas de Listeria monocytogenes EGD-e (A) y Escherichia coli MG1655 (B) en placas microtiter de poliestireno (■), AISI 304 (■) y AISI 316 (■), tras incubaci�n a 37�C durante 60 min en presencia de 500 ppm de aceite de naranja a pH 4 (5004) o pH7 (5007) o 1000 ppm de carvacrol a pH 4 (10004) o pH 7 (10007). Como control se incluyen los resultados recogidos en la Figura 1. Se muestra la media y la desviaci�n est�ndar (barras de error) de tres r�plicas independientes. La l�nea de puntos indica el l�mite de detecci�n de la t�cnica de recuento utilizada, las letras indican las diferencias significativas (p <0,05) entre materiales y sus respectivos pHs.

 

 

 

Conclusiones

�           Se demuestra que las biopel�culas de L. monocytogenes EGD-e y E. coli MG1655 desarrolladas sobre superficies de acero inoxidable no solo contienen un menor n�mero de c�lulas s�siles sino que adem�s muestran una mayor sensibilidad al ataque de alguno de los antimicrobianos testados.

�           Los tres compuestos naturales mostraron distinto grado de eficacia como agentes antimicrobianos con capacidad para reducir la presencia de c�lulas s�siles de biopel�culas de L. monocytogenes EGD-e y E. coli MG1655.

�           A las concentraciones ensayadas (500 y 1000 ppm), los tratamientos con �xido de limoneno y aceite de naranja causaron una reducci�n insuficiente (≤ 5 ciclos logar�tmicos) de las biopel�culas, independiente del pH del medio de tratamiento y el material empleado como superficie de contacto.

�           El carvacrol ha sido el agente antimicrobiano m�s eficaz frente a las biopel�culas de L. monocytogenes EGD-e y E. coli MG1655, permitiendo alcanzar niveles de inactivaci�n microbiana superiores a los 5 ciclos logar�tmicos sobre biopel�culas desarrolladas en superficies de acero inoxidable.

�           Los tratamientos aplicados en medios �cidos y neutros revelaron que el pH del medio no ejerci� efecto alguno sobre la eficacia de los antimicrobianos ensayados, en ninguna de las condiciones estudiadas (microorganismo diana, superficie de contacto, concentraci�n o tipo de antimicrobiano).

 

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�2020 por los autores. Este art�culo es de acceso abierto y distribuido seg�n los t�rminos y condiciones de la licencia Creative Commons Atribuci�n-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional (CC BY-NC-SA 4.0)

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