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Conceptualizaci�n de un estudio de la dispersi�n en microscop�a confocal crom�tica por medio de procesamiento de im�genes digitales

 

Conceptualization of a study of dispersion in chromatic confocal microscopy by means of digital image processing

 

Conceptualiza��o de um estudo de dispers�o em microscopia confocal crom�tica atrav�s de processamento digital de imagens

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Correspondencia: martin.ramirez@utelvt.edu.ec

 

Ciencias T�cnicas y Aplicadas

Art�culo de Investigaci�n

 

 

* Recibido: 17 de enero de 2025 *Aceptado: 19 de febrero de 2025 * Publicado: �24 de marzo de 2025

 

        I.            Universidad T�cnica Luis Vargas Torres de Esmeraldas, Ecuador.

      II.            Universidad T�cnica Luis Vargas Torres de Esmeraldas, Ecuador.

   III.            Universidad T�cnica Luis Vargas Torres de Esmeraldas, Ecuador.

   IV.            Universidad T�cnica Luis Vargas Torres de Esmeraldas, Ecuador.

 

Resumen

Se realiza una conceptualizaci�n del art�culo �A study of dispersion in chromatic confocal microscopy using digital image Processing�, el cual que introduce un procedimiento para microscopia crom�tica confocal por medio del uso de procesamiento de im�genes digitales para la determinaci�n del �ndice de refracci�n de una placa semitransparente. Para esto el art�culo introduce el concepto de OTM y se explica su validez como como una herramienta �til para determinar la cantidad de superficies que componen un material bajo an�lisis. As� el articulo describe la importancia del procesamiento de im�genes digitales en la microscopia confocal, abriendo grandes oportunidades a nivel acad�mico para investigaciones futuras y posteriormente en aplicaciones pr�cticas.

Palabras clave: Microscopia confocal; procesamiento de im�genes.

 

Abstract

This article presents a conceptualization of the article "A study of dispersion in chromatic confocal microscopy using digital image processing." This article introduces a procedure for confocal chromatic microscopy using digital image processing to determine the refractive index of a semitransparent plate. To this end, the article introduces the concept of OTM and explains its validity as a useful tool for determining the number of surfaces that comprise a material under analysis. The article thus describes the importance of digital image processing in confocal microscopy, opening up significant opportunities for future academic research and, subsequently, practical applications.

Keywords: Confocal microscopy; image processing.

 

Resumo

� realizada uma conceptualiza��o do artigo �A scattering study in chromatic confocal microscopy using digital image processing�, que introduz um procedimento para a microscopia crom�tica confocal atrav�s da utiliza��o de processamento digital de imagens para a determina��o do �ndice de refra��o de uma placa semitransparente. Para tal, o artigo introduz o conceito de OTM e explica a sua validade como uma ferramenta �til para determinar o n�mero de superf�cies que comp�em um material em an�lise. O artigo descreve a import�ncia do processamento digital de imagens na microscopia confocal, abrindo oportunidades significativas para futuras pesquisas acad�micas e, posteriormente, aplica��es pr�ticas.

Palavras-chave: Microscopia confocal; processamento de imagem.

 

Introducci�n

Aunque actualmente existen diversas aplicaciones para la microscopia crom�tica confocal (CCM) existen pocas o ninguna investigaci�n enfocada en la determinaci�n de la dispersi�n de un material usando procesamiento de im�genes digitales. El art�culo analizado se enfoca en el desarrollo de un procedimiento nuevo que introduce el concepto de OTM como una herramienta �til para determinar la cantidad de superficies que componen un material bajo an�lisis.

El presente art�culo tiene como objetivo hacer una breve conceptualizaci�n del procedimiento propuesto por los autores del art�culo �A study of dispersion in chromatic confocal microscopy using digital image Processing�. Para esto el art�culo hace una breve descripci�n del montaje propuesto y los conceptos introducidos como la OTM, su creaci�n, funci�n e interpretaci�n., para finalmente concluir con las posibles �reas de estudio que se abren a partir de los aportes de esta investigaci�n.

 

Desarrollo

Sistema confocal crom�tico

El montaje del sistema confocal est� compuesto por cuatro subsistemas principales:

Subsistema de iluminaci�n: Compuesto por una l�mpara hal�gena, un objetivo de 20 �, un pinhole de 50 μm y un objetivo de 10 �. El objetivo de estos elementos es generar un has colimado policrom�tico.

Subsistema de detecci�n: compuesto por un espectr�metro de fibra �ptica y un objetivo de 10 �.

Subsistema de codificaci�n de altura de longitud de onda: formado por: una lente difractiva que genera el sistema de compresi�n y aberraci�n crom�tica longitudinal, lo que permite ajustar el segmento de longitudes de onda a un rango de medida deseado.

Subsistema de escaneo: Utiliza una etapa de traducci�n motorizada nanom�trica. El sistema confocal crom�tico utilizado tiene una resoluci�n axial de 30-14 μm para una banda de luz de 510-690 nm.

En la aplicaci�n utilizada en el art�culo, una placa de material semitransparente se considera como muestra.

Para hacer la medici�n el sistema usa un cabezal �ptico (Ver Figura 1) en el cual los componentes

crom�ticos se focalizan a lo largo del eje focal en puntos espec�ficos. Si se realiza un barrido axial con un espejo plano, entonces es posible conocer la distribuci�n de todos estos componentes espectrales en el eje focal, de esta manera se utiliza una curva de calibraci�n, la cual consiste en un gr�fico de la longitud de onda frente a la posici�n axial (la posici�n donde se localiza la longitud de onda).

 

Figura 1. a) Material semitransparente dentro del segmento de longitud de onda Δλ b) la se�al detectada por el sistema.

 

Al escanear la placa semitransparente con una superficie superior y otra inferior, como se muestra en la Figura 1, se identifican dos picos que representan los dos componentes espectrales que se focalizan en las superficies del material, el m�s corto est� focalizado en la superficie inferior y el m�s largo en la superior.

El objetivo principal es, encontrar el �ndice de refracci�n del componente espectral que se refleja en la superficie inferior del material de cada espectro obtenido en cada posici�n axial, para lo cual el art�culo identifica las relaciones matem�ticas que se describen a continuaci�n.

Figura 2. Geometr�a del problema.

 

Para esto los autores se basan en la Figura 2 donde es posible encontrar las expresiones matem�ticas que permitan determinar el �ndice de refracci�n del material para cada componente espectral focalizada mediante el uso de la Ley de Snell.

Al identificar a θ1 y θ2 como los �ngulos incidentes y de refracci�n respectivamente, n1 el �ndice de refracci�n del aire y n2 el �ndice de refracci�n del medio, entonces encuentran la ecuaci�n a continuaci�n por medio la geometr�a definida en Figura 2 (b).

 

Figura 3. Escaneo axial y llenado de la matriz OTM mediante el espectro adquirido.

 

Como se puede observar, la OTM tiene informaci�n importante sobre el material que ha sido escaneado, cada tira est� asociada a una superficie del material. En este caso el material tiene dos superficies (la inferior y la superior) y por eso hay dos tiras. Adem�s, cada tira contiene los componentes espectrales que est�n focalizados en la superficie. El ancho de cada tira est� relacionado con el valor medio m�ximo de ancho completo (FWHM) de la respuesta espectral.

Puesto que la OTM es una imagen de 256 niveles de gris, es posible extraer informaci�n relevante de ella mediante binarizaci�n. Las partes importantes de la imagen son regiones cuyos niveles de gris son muy altos (regiones m�s brillantes). Luego, se realiza un proceso de esqueletizaci�n con el fin de encontrar el m�ximo de intensidad. Se utilizan dos criterios: centro geom�trico y centro de masa. El resultado es una imagen esqueletizada como la que se muestra en la Figura 4.

�Donde L es el espesor del material y d es la distancia a la cual el componente espectral λ2 se focaliza en ausencia del material.

Procesamiento de imagen para la medici�n de dispersi�n del material

Una vez identificadas las relaciones matem�ticas, el procedimiento consiste en un barrido axial de la muestra mediante un sistema de desplazamiento. Para cada desplazamiento, se adquiere el espectro relacionado con el punto axial, de manera que los datos de cada espectro ser�n una fila de una matriz que se denomina �matriz de espesor �ptico� (OTM). Cada dato del espectro, antes de ser una fila del OTM, se normaliza y codifica en 256 niveles de gris, lo cual se indica en la Figura a continuaci�n.

 

Figura 4. Procesamiento digital de la matriz OTM: (b) binarizaci�n (c) (d) esqueletizaci�n por criterio geometrico y esqueletizacion por criterio de maxima intensidad.

Una vez la imagen ha sido esqueletizada es necesario obtener dos curvas de ajuste de OTM y OTM esqueletizados. Para esto, los autores del art�culo dise�aron un algoritmo que encuentra cada p�xel blanco (nivel de gris = 1) que compone cada l�nea. Para cada p�xel encontraron la longitud de onda y el punto axial relacionado con el mismo. La longitud de onda se obtiene del espectro original y para el punto axial tomaron el n�mero de fila; y le restaron 1; finalmente el n�mero resultante lo multiplican por el paso Δz que fue utilizado por el sistema de desplazamiento. As� obtuvieron los pares ordenados asociados a cada l�nea a la cual realizaron un proceso de ajuste para obtener una expresi�n matem�tica.

Una vez finalizado el proceso de ajuste, se puede obtener la longitud de onda del gr�fico en funci�n de la posici�n axial, como se muestra en la Figura 5, en donde la l�nea azul representa todos los componentes crom�ticos que est�n focalizados en la superficie inferior del material durante el escaneo axial; mientras que el rojo se relaciona con los que se focalizan en la superficie superior.

 

Figura 5. Grafica asociada a la OTM.

 

A la gr�fica asociada obtenida en la Figura 5 es posible hacerle un corte horizontal o vertical para obtener la dispersi�n. Para el caso del corte horizontal a la OTM, el corte tendr� dos puntos de interceptaci�n que est�n relacionados con las longitudes de onda λ1 y λ2. El primer componente se focaliza en la superficie superior y el segundo en la inferior, y el �ndice de refracci�n se calcula utilizando la ecuaci�n (1) para el �ltimo componente.

De la ecuaci�n (1) se conocen todos los par�metros. En el caso de d, es necesario evaluar ambas longitudes de onda λ1 y λ2 en la curva de calibraci�n y luego mirar el valor de la distancia entre ellas. Esta es la forma en que se conoce el �ndice de refracci�n para λ2 en esta posici�n Z. El objetivo es seguir haciendo cortes horizontales sucesivos, para obtener la gr�fica de �ndice de refracci�n versus longitud de onda, as� se puede conocer la dispersi�n del material.

 

Conclusiones

Aunque la microscopia confocal tiene como caracter�stica principal la propiedad de poder hacer discriminaci�n con base a la profundidad, los autores del art�culo proponen un m�todo innovador que mantiene esta caracter�stica y adicionalmente evita movimiento axial del objeto. Por medio de la microscopia confocal crom�tica los autores proponen una aplicaci�n para la identificaci�n del �ndice de refracci�n en una placa semitransparente, la cual puede ser �til para aplicaciones como operaciones oftalmol�gicas (como las cataratas o inflamaci�n de la c�rnea).

Para esto los autores proponen un procedimiento nuevo e introducen el concepto de OTM, matriz que contiene informaci�n importante como la cantidad de superficies que componen el material (relacionado con el n�mero de tiras), estima el grosor �ptico del material (asociado a la distancia entre p�xeles de m�ximo nivel de gris) y estimaci�n de la resoluci�n axial del sistema (desde el ancho de las tiras).

Se concluye que la investigaci�n tiene muchas �reas de seguimiento, entre ellas se menciona una limitaci�n en el c�lculo del �ndice de difracci�n introducido por la resoluci�n axial del sistema actual (FWHM de 30-14 um para banda entre 510-690 nm), por lo cual se podr�an reproducir los resultados con una resoluci�n axial diferente.

El art�culo demostr� que la dispersi�n de un material se puede encontrar a partir de cortes sucesivos horizontales o verticales en la OTM, por lo cual se concluye que se podr�a aplicar en estudios sobre errores introducidos por la resoluci�n axial del sistema. Adicionalmente, la metodolog�a propuesta basada en el procesamiento de im�genes digitales abre muchas oportunidades en t�rminos acad�micos para �reas de investigaci�n en la microscop�a confocal crom�tica por medio de procesamiento de im�genes digitales.

Por lo tanto, se concluye que el art�culo es importante a nivel acad�mico puesto que introduce el concepto de OTM y explica su validez, junto con el procesamiento de im�genes digitales en la microscopia confocal, abriendo grandes oportunidades a nivel acad�mico y posteriormente en aplicaciones pr�cticas como las mencionadas anteriormente.

 

Referencias

      1.            J. Garzon, �Montaje Confocal Cromatico. Laboratorio Metrologia Optica.� Universidad Pontificia Bolivariana, Medellin, 2020.

      2.            D. Duque, J. Garz�n, and T. Gharbi, �A study of dispersion in chromatic confocal microscopy using digital image processing,� Opt. Laser Technol., vol. 131, no. June 2019, p. 106414, 2020.

 

 

 

 

 

 

 

 

� 2025 por los autores. Este art�culo es de acceso abierto y distribuido seg�n los t�rminos y condiciones de la licencia Creative Commons Atribuci�n-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional (CC BY-NC-SA 4.0)

(https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/).