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Evaluaci�n de tres dilutores comerciales sobre el semen de ovino post-congelaci�n

 

Evaluation of three commercial extenders on post-freezing sheep semen

 

Avalia��o de tr�s diluidores comerciais em s�men ovino p�s-congela��o

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Correspondencia: chichochachi116@gmail.com

 

Ciencias de la Salud

Art�culo de Investigaci�n

 

 

* Recibido: 19 de noviembre de 2024 *Aceptado: 02 de diciembre de 2024 * Publicado: �29 de enero de 2025

 

        I.            Universidad Cat�lica De Cuenca, Ecuador.

      II.            Universidad Cat�lica De Cuenca, Ecuador.

   III.            Universidad Cat�lica De Cuenca, Ecuador.

   IV.            Universidad Cat�lica De Cuenca, Ecuador.

 

Resumen

La cr�a de ovinos tiene un impacto significativo en la econom�a del pa�s, sin embargo, en esta industria suelen mantener pr�cticas de manejo tradicionales, lo que resta competitividad internacional, por esto es primordial mejorar la producci�n ovina mediante la mejora gen�tica de animales con alto potencial productivo y reproductivo. El objetivo de la presente investigaci�n fue evaluar la eficiencia de tres dilutores comerciales, Ovixcell, Andromed y Triladyl sobre la calidad esperm�tica del semen ovino postcongelaci�n. De acuerdo a los par�metros de cada casa comercial en semen de carneros de las razas Katahdin, Pelibuey y Dorper, con 15 extracciones, 5 por cada ovino, para un total de 45 muestras, evaluadas mediante microscopia tradicional por tinci�n, fluorescencia, pH, adem�s se incluyeron par�metros cin�ticos evaluados mediante el sistema CASA, todas las variables fueron evaluadas en dos intervalos, en semen fresco reci�n diluido y postcongelaci�n. En los an�lisis de permeabilidad y progresividad en semen fresco diluido, Triladyl obtuvo resultados eficientes (p< 0.05), mientras que en cin�tica Andromed y Triladyl lograron un impacto notable (p< 0.05), al analizar los par�metros mencionados en postcongelaci�n Triladyl obtuvo resultados significativos (p< 0.05) mientras que los otros testigos rotaron, Ovixcell en segundo lugar demostrando mejor resistencia a la criopreservaci�n (p< 0.05) ante Andromed, el cual ha evidenciado un descenso significativamente dr�stico, indicando alta mortalidad en semen descongelado. Se concluye que el diluyente Triladyl preserva mejor las caracter�sticas funcionales del esperma ovino al proteger la membrana plasm�tica, conservando la vitalidad y brindando mayor protecci�n ante las consecuencias de la criopreservaci�n.

Palabras clave: ovino; esperma; diluyente; crio preservaci�n.

 

Abstract

Sheep breeding has a significant impact on the country's economy, however, this industry often maintains traditional management practices, which reduces international competitiveness, so it is essential to improve sheep production through genetic improvement of animals with high productive and reproductive potential. The objective of this research was to evaluate the efficiency of three commercial extenders, Ovixcell, Andromed and Triladyl on sperm quality of post-freezing sheep semen. According to the parameters of each commercial house in semen from rams of the Katahdin, Pelibuey and Dorper breeds, with 15 extractions, 5 for each sheep, for a total of 45 samples, evaluated by traditional microscopy by staining, fluorescence, pH, in addition kinetic parameters evaluated by the CASA system were included, all variables were evaluated in two intervals, in fresh semen recently diluted and post-freezing. In the permeability and progressiveness analyses in fresh diluted semen, Triladyl obtained efficient results (p< 0.05), while in kinetics Andromed and Triladyl achieved a notable impact (p< 0.05). When analyzing the mentioned parameters in post-freezing Triladyl obtained significant results (p< 0.05) while the other controls rotated, Ovixcell in second place demonstrating better resistance to cryopreservation (p< 0.05) before Andromed, which has shown a significantly drastic decrease, indicating high mortality in thawed semen. It is concluded that the Triladyl extender better preserves the functional characteristics of ovine sperm by protecting the plasma membrane, preserving vitality and providing greater protection against the consequences of cryopreservation.

Keywords: ovine; sperm; extender; cryopreservation.

 

Resumo

A ovinocultura tem um impacto significativo na economia do pa�s, no entanto, esta ind�stria mant�m muitas vezes pr�ticas de maneio tradicionais, o que reduz a competitividade internacional, pelo que � essencial melhorar a produ��o de ovinos atrav�s do melhoramento gen�tico de animais com elevado potencial produtivo e reprodutivo. O objetivo desta investiga��o foi avaliar a efici�ncia de tr�s diluidores comerciais, Ovixcell, Andromed e Triladyl na qualidade esperm�tica do s�men ovino p�s-congelado. De acordo com os par�metros de cada casa comercial em s�men de carneiros das ra�as Katahdin, Pelibuey e Dorper, com 15 extrac��es, 5 para cada ovelha, para um total de 45 amostras, avaliadas por microscopia tradicional por colora��o, fluoresc�ncia, pH, para al�m de Foram inclu�dos par�metros cin�ticos avaliados pelo sistema CASA, todas as vari�veis ​​foram avaliadas em dois intervalos, em s�men fresco, recentemente dilu�do e p�s-congela��o. Nas an�lises de permeabilidade e progressividade em s�men fresco dilu�do, o Triladyl obteve resultados eficientes (p < 0,05), enquanto que na cin�tica o Andromed e o Triladyl obtiveram um impacto assinal�vel (p < 0,05), ao analisarem os par�metros referidos no p�s-congelamento o Triladyl obteve resultados significativos . descongelado. Conclui-se que o diluente Triladyl preserva melhor as caracter�sticas funcionais do esperma ovino, protegendo a membrana plasm�tica, preservando a vitalidade e proporcionando uma maior prote��o contra as consequ�ncias da criopreserva��o.

Palavras-chave: ovelhas; esperma; mais fino; criopreserva��o.

 

Introducci�n

La importancia de la criopreservaci�n de esperma es crucial tanto para salvar especies y razas en peligro como para mejorar gen�ticamente razas productivas, en Ecuador incluido otros pa�ses Andinos, las pol�ticas gubernamentales han priorizado a los programas que conservan el material gen�tico local (Moreno et al., 2019). La crioconservaci�n facilita la reproducci�n al permitir el transporte del esperma a grandes distancias e incluso su uso post mortem del progenitor, sin embargo, esta t�cnica puede afectar la viabilidad y actividad de los espermatozoides debido a posibles da�os durante el proceso (Saha et al., 2022). Los espermatozoides han demostrado presentar en mayor grado sensibilidad hacia la congelaci�n, para contrarrestar este efecto y mejorar la fertilidad del semen, se introdujo el uso de dilutores, unos a base de prote�na animal, vegetal y otros a base de azucares, todos actuando como agentes criopreservantes (Gonz�lez et al., 2022), pues nivelan las concentraciones de sal, controlan la contracci�n celular, previenen la formaci�n de hielo al interior de las c�lulas y disminuyen la fracci�n congelada de la soluci�n (Saha et al., 2022). Si bien se han utilizado varios dilutores para congelar el semen ovino, no hay un an�lisis bien establecido que determine que diluyente produce los mejores resultados en la fase de descongelaci�n (Cely et al., 2021).

Saha et al (2022) describe que es una pr�ctica fundamental para el avance en las tecnolog�as reproductivas. Consiste en aplicar temperaturas excesivamente bajas para provocar a la c�lula una pausa vital durante largos periodos de tiempo, este m�todo es primordial para preservar espermatozoides, aunque puede llegar afectar la membrana plasm�tica provocando da�os permanentes, muerte de la c�lula e infertilidad, adem�s hay que tener en cuenta que el �xito de la crioconservaci�n es dependiente del tipo de dilutor empleado (Duque & Casta�o., 2018). La criopreservaci�n de semen ovino a diferencia de otros mam�feros resulta un proceso complejo pues este es m�s susceptible a choques t�rmicos, lo que provoca mayor da�o celular (Saha et al., 2022).

Durante el proceso de enfriamiento, el hielo extracelular provoca que el espermatozoide permanezca en un ambiente hipert�nico, ya que al existir fracciones no congeladas provoca la salida de agua de las c�lulas, es decir, en un intento por equilibrar solutos, se deshidrata, al descongelar este proceso se revierte enfrentando condiciones hipot�nicas que favorecen el ingreso de agua, provocando su hinchaz�n, contrariamente a la congelaci�n r�pida donde la deshidrataci�n es menor pero forma cristales de hielo intracelular causando altos �ndices de mortalidad (Sharafi, 2022), sumado a que por el da�o celular provocado por la temperatura se genera una disminuci�n sobre la calidad esperm�tica (Akhtar & Quingshan, 2022), llegando a comprometer la integridad del ADN, mediado por las protaminas P1 Y P2 encargadas de brindar protecci�n al material gen�tico, que al sufrir da�os parecen interferir entre los puentes de disulfuro de la ciste�na, llegando afectar su funci�n y fertilidad (Ortiz et al., 2022).

La relaci�n entre los Criopreservantes y dilutores se centra en la presunci�n de roles complementarios, pero operan de manera distinta, ambos deben cumplir la funci�n de proteger al esperma durante la congelaci�n (Duque & Casta�o, 2018).� El da�o provocado por la criopreservaci�n afecta la estructura y funci�n de los espermatozoides, com�nmente debido a factores como el estr�s t�rmico, osm�tico y oxidativo, para disminuir estos efectos se incorporan crioprotectores, cuya funci�n es atenuar el da�o celular durante el protocolo de congelaci�n y descongelaci�n, aparte de prevenir la formaci�n de cristales de hielo (Ozimic et al., 2023).

Los dilutores aumentan el volumen del semen, ayudan a conservar la viabilidad (Guerrero et al., 2009), y facilitan a cumplir las dosis necesarias, su principal objetivo es mantener la capacidad de fecundaci�n, al mismo tiempo que aportan nutrientes esenciales para efectuar el mecanismo de metabolizaci�n, protegen contra el shock t�rmico, controlan la presi�n osm�tica, regulan el pH e impiden el desarrollo de microorganismos (Cando-Carrasco et al., 2023).

Se conoce presentaciones de dilutores, los de un paso hace referencia a los que ya contienen crioprotector en su formulaci�n, mientras que los diluyentes de dos pasos, se a�ade primero el diluyente sin crioprotector y despu�s del enfriamiento se agrega el diluyente que ya incluye crioprotector, lo que reduce el estr�s de los espermatozoides aumentando notablemente la supervivencia esperm�tica, caracter�sticas que con los dilutores de una sola etapa corren alto riesgo (Saha et al., 2022).

En relaci�n a la composici�n de los diluyentes Nisfimawardah et al. (2023) indica que Andromed est� elaborado sin compuestos de origen animal, contiene fosfol�pidos, TRIS, �cido c�trico, az�cares, glicerina, agua bidestilada y antioxidantes. Ovixcell esta formulado principalmente por lecitina de soya (Arbulu, 2019), incluye electrolitos, agua pura, sal, az�car, glicerol, antibi�ticos y ciertos componentes que se desconocen pues estos no figuran en la lista del fabricante (Nisfimawardah et al., 2023).

A Triladyl se le debe a�adir su compuesto principal que es la yema de huevo (Torres & Corredor, 2015), tambi�n contiene un buffer sint�tico metil aminometano (TRIS), �cido c�trico, fructosa, agua bidestilada, glicerol, para Andromed y Triladyl se describen antibi�ticos similares 5 mg de tilosina, 25 mg de gentamicina, 15 mg de lincomicina y 30 mg de espectinomicina (Nisfimawardah et al., 2023).

En este contexto, los dilutores con az�cares son incluidos como nutrientes, el az�car debe ser agregado en la formulaci�n sin excepci�n, ya que se convierte r�pidamente en energ�a, favoreciendo a la motilidad esperm�tica, esta energ�a externa es fundamental para que las c�lulas mantengan la capacidad de moverse, los monosac�ridos m�s usados son la glucosa y la fructosa, estas son especialmente importantes ya que se transforman en lactato y piruvato (Alomar, 2023), compuestos cruciales para mejorar significativamente la motilidad, viabilidad y mantener la integridad de la membrana plasm�tica (Kamal, 2023), as� mismo los espermatozoides al ser sensibles a la criopreservaci�n y sufrir da�os son susceptibles a disminuir la fertilidad (Moura et al., 2022). Los monosac�ridos act�an mediante sus mol�culas que al penetrar en las c�lulas esperm�ticas generan movimiento flagelar dado por la glicolisis y la fosforilaci�n oxidativa de la mitocondria (Luzko et al., 2018).

Un compuesto disac�rido muy conocido es la trehalosa, esta se destaca por su capacidad de producir hiperosmolaridad para impulsar la salida de agua de las c�lulas, sin penetrarla, lo que no permite la formaci�n de cristales de hielo dentro de ellas, al mismo tiempo, asegura el equilibrio osm�tico y brinda una protecci�n adicional a los espermatozoides frente a los da�os causados por cambios de temperatura (Chen et al., 2004).

Por otro lado, los dilutores con Buffer incluyen la protecci�n de pH en el medio es crucial para preservar las funciones vitales, ya que tanto la actividad enzim�tica y las reacciones qu�micas celulares dependen de su capacidad de mantenerse controlado dentro del rango espec�fico (Fi�ana et al., 2021).

El pH en el carnero se sit�a entre 6,5 y7,0 (Condori & Kantuta, 2021). A medida que los espermatozoides envejecen, como resultado de la glucolisis el �cido l�ctico se concentra en gran cantidad, lo que reduce el pH intracelular, este descenso los inmoviliza afectando la motilidad, para evitarlo, es crucial estabilizar el pH del medio mediante tampones (Reyes et al., 2021), estos contribuyen a contrarrestar los efectos t�xicos del �cido l�ctico, manteniendo la viabilidad de las c�lulas (Duque & Casta�o, 2018).

Entre los tampones de uso frecuente se encuentra el trisfosfato hidroximetil aminometano (TRIS), y fosfato salino, aunque este �ltimo no es adecuado para la congelaci�n debido al contenido prominente de sodio lo que provoca alteraciones en las bombas de sodio potasio, como resultado su alta toxicidad dentro de las c�lulas esperm�ticas, pese a todos los beneficios que ofrecen� los tampones, los extender que en su formulaci�n son enriquecidas con az�car, carecen de un buffer de pH (Fern�ndez et al., 2009).

El amortiguador de pH m�s usado es la yema de huevo, este act�a como un buffer al adherirse a la membrana, form�ndose como una especie de capa protectora gracias a su alta concentraci�n de lipoprote�nas, fosfol�pidos y lecitinas, mol�culas clave para efectuar su capacidad protectora contra el choque t�rmico (Saha et al., 2022).

Asimismo, en relaci�n a los dilutores con medios org�nicos (Salifu et al. (2022) sostiene que los diluyentes al contener alg�n tipo de medio org�nico, por su origen natural, pueden llegar a ser menos t�xicos, aportando una protecci�n eficiente para preservar la viabilidad esperm�tica.

Un medio org�nico com�n m�s usado es la yema de huevo, este ayuda a prevenir el da�o oxidativo (Sheshtawy et al., 2017), gracias a sus nutrientes como vitamina E, Selenio, estos protegen la membrana plasm�tica (Czelej et al., 2023). Sin embargo, el riesgo de contaminaci�n microbiana por el uso de medios org�nicos es alta, con organismos como Streptococcus, Escherichia coli, Staphylococus aureus y Pseudomonas aeruginosa, aunque se ha demostrado que estos no son una amenaza al momento de inseminar debido a la acci�n de los antibi�ticos formulados en el diluyente (Duque & Casta�o, 2018).

Es por esto que se ha creado medios org�nicos vegetales como la ca�a de az�car, su extracto contiene minerales, vitaminas, az�cares, adem�s de ofrecer propiedades antimicrobianas, citoprotectoras y antioxidantes (Salifu et al., 2022). Todos estos compuestos han mostrado mejorar notablemente la conservaci�n del esperma cuando se incorporan en diluyentes, adem�s fuentes vegetales como remolachas son ricas en az�cares por lo que ayudan en la respiraci�n celular y brindan un equilibrio osm�tico a los espermatozoides, tambi�n se incluyen las frutas como naranja, pi�a y manzana que contienen altos niveles de vitamina C, y en general estos medios est�n compuestos por �cidos fen�licos y flavonoides, los cuales tienen potentes efectos antioxidantes (Bozzi et al., 2023).

Por otro lado, los crioprotectores penetrantes sustituyen el fluido interno por la sustancia protectora, es decir se deshidratan y se rehidratan, lo que provoca una contracci�n celular y protege al espermatozoide de da�os causados por la formaci�n de hielo al exterior de la c�lula, el m�s com�n es el glicerol (Duque & Casta�o, 2018). En general el tama�o de las mol�culas de este grupo es� inferior a 100 daltons, forman enlaces de hidr�geno con el agua, esto es clave para ejercer sus propiedades, deben atravesar la membrana biol�gica con facilidad ser solubles en agua a bajas temperaturas, y ser poco t�xicos, mientras que el grupo de los no penetrantes act�an extracelularmente, son mol�culas m�s grandes, compuestas por d�meros, tr�meros o pol�meros, estos compuestos promueven la vitrificaci�n mediante el mecanismo del grupo penetrante aunque su efecto es exclusivamente extracelular y con menos intensidad, entre los m�s utilizados se encuentran el polietilenglicol, la rafinosa, trehalosa, la sacarosa (Whaley et al., 2021), la lecitina de soja es conocida por mantener la estructura de la c�lula estable (Crespilho et al., 2012).

Tambi�n dentro de este grupo se incluye a la yema de huevo, este protege a la membrana acros�mica, celular, las mitocondrias, preserva la motilidad y resguarda a las c�lulas del choque t�rmico, mientras que los crioprotectores penetrantes se inclinan a ser efectivos en proteger la cin�tica, morfolog�a y motilidad (Saratsi, 2024), los no penetrantes son menos t�xicos para los espermatozoides, esto por su cantidad similar en moles (Amini, 2023).

En cuanto a la espermiograma tradicional Maside et al. (2023) da a conocer que la estandarizaci�n de este tipo de an�lisis sigue siendo compleja, varios factores de confusi�n dificultan obtener resultados contundentes, los an�lisis de la estructura se mide seg�n la apariencia, morfolog�a, concentraci�n e integridad de la membrana plasm�tica, los an�lisis funci�nales incluyen motilidad, viabilidad y actividad mitocondrial. Estas son t�cnicas centradas espec�ficamente para la evaluaci�n manual mediante microscopia tradicional, aunque demanda una cantidad significativa de tiempo y recursos (Kathrin et al., 2018).

La prueba de eosina nigrosina permite diferenciar entre espermatozoides vivos y muertos, estos �ltimos al tener la membrana plasm�tica comprometida ti�en el fondo, mientras que los espermatozoides vivos no adquieren color (Tanga et al., 2021). El yoduro de propidio eval�a la viabilidad, es un fluorocromo que no puede atravesar la membrana celular funcional intacta, solo penetra aquellos que tienen la membrana da�ada pronunci�ndose con una fluorescencia roja en ellos, en cambio la rodamina se utiliza para estudiar la actividad de la membrana mitocondrial, este reactivo si es permeable por lo que ingresa y emite fluorescencia verde en las c�lulas, la cual es m�s intensa en las mitocondrias que funcionan correctamente (Maside et al., 2023).

En el sistema tradicional el an�lisis de fluorescencia usando rodamina y yoduro de propidio evidencian mayor confianza (Whitesell et al., 2020). Host es un an�lisis de hinchaz�n hipo osm�tico se emplea para valorar la integridad funcional de las membranas, solo las c�lulas con la membrana funcional intacta mantienen el equilibrio interior y exterior de la c�lula de esta manera tiene el poder de responder a cambios en su entorno, al ser sometido a condiciones hipo osm�ticas, las c�lulas absorben l�quido, lo que provoca la hinchaz�n y enrollamiento de la cola, este suceso indica una membrana en buen estado (Prochowska et al., 2022).

El sistema CASA (Computer Assisted Semen Analysis) permite rastrear el recorrido de cada espermatozoide, siendo capaz de llevar a cabo un an�lisis fisiol�gico a partir de la capacidad de avance progresivo (Guill�n et al., 2021). Eval�a variables de cin�tica como vitalidad, concentraci�n, es eficaz al medir motilidad, ofrecen mayor exactitud en los resultados, lo que por ende determina una evaluaci�n precisa de la muestra, siguen siendo poco aprovechados a pesar de que este avance tecnol�gico ya fue introducido (Singh et al., 2021), tambi�n eval�a la velocidad promedio de los espermatozoides en un tiempo determinado, la oscilaci�n, rectitud y linealidad, as� como la frecuencia de batida del flagelo y el movimiento lateral de la cabeza del espermatozoide (Akhtar & Quingshan, 2022).

Este an�lisis computarizado mejora su exactitud en 2005 donde se agrega FASTCLUS un enfoque no jer�rquico, donde se implementa pseudo F, pseudo t2 y el criterio c�bico clusterizado, esto permite una mejor clasificaci�n de los sub grupos esperm�ticos (Corredor et al., 2018), permitiendo analizar con precisi�n, rapidez y de manera objetiva diversos par�metros del semen, adem�s de identificar alteraciones sutiles en las caracter�sticas esperm�ticas que no pueden detectarse mediante espermiograma tradicional (Rijsselaere et al., 2012).

 

Materiales y m�todos

El estudio se realiz� en Unidad Acad�mica de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Cat�lica de Cuenca, provincia del Azuay, Cant�n Cuenca, con su localizaci�n en el kil�metro 2� de la Panamericana Norte. Ejecutando la evaluaci�n de tres tipos de dilutores comerciales, Andromed, Ovixcell y Triladyl, en semen de ovino de las razas Dorper, Katahdin y Pelibuey, con 5 extracciones por ovino para un total de 45 muestras para el estudio completo. Para analizar las variables se realizo un Dise�o de Bloque completamente al azar (DBCA), con un nivel de significancia (p< 0,05), los grupos fueron comparados con la prueba de TUKEY, los resultados de la media y la desviaci�n est�ndar se analizaron en el programa JAMOVI PROJECT 2022.

 

Materiales

Con una vagina artificial de IMV Technologies lavada, secada y armada, se coloc� un volumen de 40 a 60 ml de agua entre 45 - 47 �C, esta fue protegida a una temperatura corporal de 37 - 38 �C hasta llegar a la granja y colectar el semen, por la v�lvula introducimos aire provocando que el revestimiento de l�tex se estreche al ancho del dedo �ndice, el esperma fue colectado en tubos Falcon de 15ml y resguardado con la mano para evitar contaminaci�n y cambios dr�sticos de temperatura.

Al llegar al laboratorio con una micropipeta de 100/1000 �l se midi� el volumen seminal, inmediatamente realizamos el conteo de espermatozoides en el fot�metro Minitube especial para ovinos, este par�metro fue evaluado con 5 microlitros de semen, por �ltimo, en un portaobjetos ya estabilizado a 37 �C se coloc� 5 microlitros de esperma previamente homogenizado, esto para medir la motilidad masal.

Dentro de la cabina de flujo laminar y materiales est�riles se prepar� la predisoluci�n de los 3 diluyentes comerciales, Andromed a una raz�n de 1:4, una parte de diluyente y 4 partes de agua ultra pura, Ovixcell 1:1, una parte de agua ultra pura y una parte de diluyente, Triladyl 1:1:3 una parte de diluyente, una de yema y 3 partes de agua ultra pura, la yema fue cuidadosamente extra�da con papel filtro y su contenido fue succionado desde dentro de su membrana con una jeringa de 3ml, esto para evitar la contaminaci�n con la clara.

La proporci�n de soluci�n madre se determin�, tomando en cuenta que la motilidad masal fue de 95%, incluyendo el valor del volumen y la concentraci�n del esperma, se calcul� las soluciones de cada diluyente para llegar a los 50 millones de espermatozoides, el resultante se dosifico para pajillas de 0,25cc y se rest� la predilucion.

Una vez calculado se homogeneizo en tubos eppendorf previamente rotulados tomando el semen puro y las soluciones de manera cuidadosa, estos estuvieron a 37 �C a ba�o mar�a antes de la mezcla, fueron empajilladas tres muestras para cada diluyente, en total 135 pajillas para el estudio completo, selladas adecuadamente con alcohol polivin�lico para evitar el desbordamiento y rotuladas por raza de ovino, dilutor y fecha.

Sujetando la pajilla de su extremo se coloc� en la rampa aline�ndolas de forma horizontal para ser estabilizadas durante dos horas, ya preparada la c�mara de congelaci�n con nitr�geno l�quido se introdujo las pajillas a los vapores de nitr�geno por 12 minutos para, pasado este tiempo las pajillas fueron introducidas por completo en nitr�geno l�quido para posteriormente llevarlos al termo criog�nico.

Las repeticiones fueron descongeladas un mes despu�s a 37 �C por un tiempo de 40 segundos, se elimin� todo rastro de humedad de la pajilla y se deposit� la muestra en tubos eppendorf, las muestras fueron colocadas inmediatamente en la platina t�rmica a 37�C para evitar impactos bruscos de temperatura y finalmente volver a evaluar los siguientes par�metros que se detallan a continuaci�n.

El pH fue analizado en papel tornasol colocando microgotas de 1μL para semen puro y post congelaci�n, con la que revelo la coloraci�n de pH transcurrido aproximadamente 1 minuto despu�s de colocar la muestra.

Se evidenci� la viabilidad de los espermatozoides con cada diluyente, aplicando una microgota al extremo de la placa de 3μL de reactivo y 3μL de esperma para realizar el frotis, para esta prueba se hizo uso del lente de 40x, contemplando a los espermatozoides sin coloraci�n como vivos y para los espermatozoides con coloraci�n como muertos.

La integridad de la membrana fue valorada microsc�picamente con lente de 40x usando 100μL de reactivo con 20μL de semen homogeneizadas en un tubo eppendorf, fueron colocados a incubaci�n en la platina t�rmica a 37�C durante 45 minutos, transcurrido este lapso de tiempo retiramos y analizamos, haciendo uso de un cubre y porta objetos colocamos 5μL de muestra, donde se pudo observar espermatozoides con cola lisa y enrollada, este �ltimo grupo est� relacionado con el buen estado de la membrana.

La viabilidad tambi�n fue evaluada mediante fluorescencia, tomando 50μL de semen y 1μL del reactivo, la muestra fue colocada en tubos eppendorf protegidos con aluminio e incubadas en la platina t�rmica por 5 minutos, una vez transcurrido el tiempo de incubaci�n retiramos, tomamos 5μL de muestra, realizamos el frotis y analizamos con lente 100x, disco #1.

Examinamos la actividad mitocondrial mediante fluorescencia, tomando 1μL de rodamina 123 y 50μL de semen, una vez colocada la muestra en el tubo eppendorf se incubo por 5 minutos en la platina t�rmica, retiramos de incubaci�n, tomamos 5μL de la muestra y realizamos el frotis, se emple� el lente de 100x, disco #3 para su an�lisis.

Para el an�lisis de semen asistido por ordenador se incluyeron indicadores como la motilidad progresiva (PR), la motilidad no progresiva (NP), espermatozoides inm�viles (IM), velocidad con trayectoria curvil�nea (VCL), la velocidad promedio (VAP), la velocidad con trayectoria rectil�nea (VSL), la rectitud en porcentaje (STR), la linealidad en porcentaje (LIN), la amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH) y la frecuencia rectil�nea de batida del flagelo (BCF). Para esta evaluaci�n se rotulo un porta objetos diferente para cada diluyente por nombre, colocamos 5μL de cada muestra y protegimos la microgota con un cubre objetos, tanto como para an�lisis de semen fresco diluido como para la post-congelaci�n las muestras fueron evaluadas inmediatamente, capturando 3 campos por muestra.

 

Resultados

Una vez consideradas las muestras homog�neas de los tres ovinos donadores se procedi� a realizar el an�lisis de varianza de las diferencias entre los tratamientos de Andromed, Ovixcell y Triladyl para las variables de permeabilidad, progresividad y la cin�tica esperm�tica evaluadas en semen fresco con el diluyente donde se pudo observar lo siguiente:

 

Tabla 1: An�lisis de semen fresco diluido

 

Para la prueba de Eosina, el test de Host, Yoduro de propidio y Rodamina se presentaron diferencias estad�sticas (p< 0.05) con valores < 0.001, detallados en la tabla 1, donde en secuencia alfab�tica cada literal difiere de los otros tratamientos, siempre a favor del Triladyl, seguido por Andromed y finalmente Ovixcell.

En cuanto a progresividad, con una variaci�n estad�stica de (p< 0.05) con valores < 0.001, destacan a Triladyl, continuado por Andromed y por �ltimo Ovixcell.

Se revelo un pH inicial de (7.00+/-0.00) en semen fresco evaluado sin diluyente, en cuanto a la motilidad antes de congelar esta evidencia una diferencia de (p< 0.05) con resultados < 0.001 claramente favoreciendo a Triladyl, sucedido por Andromed y por �ltimo Ovixcell.

En lo que concierne a los par�metros cin�ticos de igual modo tuvieron diferencias estad�sticas (p< 0.05), para VCL, VAP, VSL, ALH Y BCF con valores < 0.001, STR con valores de 0.016 y LIN con un valor de 0.009, evidenciando a los dilutores Andromed y Triladyl con resultados superiores al Ovixcell.

 

Tabla 2: An�lisis de semen post congelaci�n

 

Al medir el an�lisis de varianza de las muestras postcongelaci�n se revelo diferencias entre los dilutores Andromed, Ovixcell y Triladyl para la permeabilidad, progresividad y la cin�tica.

Se pudo observar que para para Eosina, Host, Yoduro de propidio y Rodamina hubo diferencias estad�sticas (p< 0.05) con valores < 0.001, detallados en la tabla 2, donde en secuencia alfab�tica cada literal difiere de los otros tratamientos, adjudicando siempre resultados positivos para Triladyl, seguido por Ovixcell y finalmente Andromed.

�Con respecto a la progresividad con una variaci�n estad�stica (p< 0.05) con valores < 0.001 resaltan en primer t�rmino a Triladyl, seguido de Ovixcell y por �ltimo Andromed.

El pH del Triladyl se mantuvo (7.00+/-0.00) mientas que del Andromed bajo a (6.00+/-0.00) y del Ovixcell descendi� a (5.50+/-0.00), en cuanto a la motilidad postcongelaci�n con una diferencia de (p< 0.05) con resultados < 0.001, evidentemente favoreciendo en primer plano a Triladyl, continuando con Ovixcell y por �ltimo Andromed.

Con respecto a los par�metros cin�ticos de igual modo tuvieron diferencias estad�sticas (p< 0.05), para par�metros como VCL, VAP, VSL, ALH Y BCF con valores < 0.001, para STR con resultados de 0.002 y LIN con una puntuaci�n de 0.022, siempre destacando de manera positiva al diluyente Triladyl, seguido por Ovixcell y por �ltimo Andromed.

 

Ilustraci�n 1: PR en fresco y congelado, Andromed, Ovixcell y Triladyl

 

Para finalizar, se evidencia en la figura 3 las diferencias entre semen fresco y congelado, donde se puede observar una deca�da radical de los valores, pese a esto se puede constatar que en cuanto a vitalidad el Triladyl con 48,6% mantiene la calidad del esperma ovino, llama la atenci�n el efecto de estos criopreservantes y su cambio sobre el semen fresco.

 

Discusi�n

El espermiograma tradicional se cataloga como impreciso y sesgado, este tiene varias limitantes en cuanto a variabilidad y movilidad, en consecuencia, afectan la objetividad de las evaluaciones, para esto se incluy� el sistema casa ya que obtiene an�lisis precisos logrando sustituir a los an�lisis tradicionales (Valverde & Madrigal, 2018).

En nuestro estudio el diluyente m�s efectivo fue el Triladyl. Al parecer los diluyentes a base de yema de huevo demuestran mayor eficacia en comparaci�n a otros diluyentes vegetales. (Saratsi, 2024) evidencia que al comparar a Steridyl, mismo que ya contiene yema esterilizada en su formulaci�n, con otros diluyentes, este proporcion� una mayor eficacia en la conservaci�n de las cualidades vitales de los espermatozoides, as� mismo (Barbas, 2023) formularon un diluyente a base de yema de huevo nombrado EZN S - EXT donde, (Fernandes et al., 2021) alude que este diluyente conservo mejor el esperma descongelado, de igual manera (Rimi et al., 2023) recalca que Triladyl evidencio un mayor n�mero de espermatozoides vivos post-congelaci�n y con la mejor tasa de concepci�n, siendo determinado como el m�s efectivo para la crioconservaci�n de semen en cabras, (Hurtado, 2023) asegura que Triladyl destaco, al ser superior sus �ndices de motilidad antes y despu�s de la congelaci�n, como el diluyente m�s efectivo para preservar el semen, tal cual lo verifica (Izquierdo et al., 2023) en ovinos de raza Suffolk Ingl�s, donde en 0 horas la motilidad y viabilidad fueron superiores con Triladyl.

(Mui�o & Pe�a, 2009) Insiste en que estos resultados pueden deberse a las lipoprote�nas de la yema, estas protegen a la membrana del espermatozoide, durante la congelaci�n y post congelaci�n, adem�s de tener un alta compatibilidad con las prote�nas del plasma seminal, estas �ltimas al eyacular se adhieren a la membrana de los espermatozoides, siendo la raz�n fundamental de la perdida de colesterol y fosfol�pidos, esto es grave ya que debilita la integridad de la membrana y lo hace m�s d�bil al frio, por lo tanto, las� lipoprote�nas de la yema se juntan a las� prote�nas del plasma seminal y bloquean este impacto nocivo. Ayudando a preservar la integridad de la membrana (Czelej et al., 2023).

En cuanto al pH en nuestro estudio si se encontr� diferencias post-congelaci�n entre los diluyentes, siendo Triladyl el �nico en mantener su valor inicial, tal cual el estudio de (Izquierdo et al., 2023) donde Triladyl mantiene su pH, coloc�ndolo en primer lugar como una alternativa eficaz para conservar semen ovino. Seg�n (Mart�nez et al., 2020) en su estudio con 5 dilutores certifica que hay una relaci�n entre el pH y el n�mero de espermatozoides m�viles, resalta que en un pH bajo los espermatozoides carecen de movilidad sin embargo estos van presentado movimiento conforme mejora el pH con otros diluyentes, as� lo confirma (Paez et al., 2020) donde al incluir yema de huevo afirma que esta potencia la velocidad de los espermatozoides.

Las diferencias de pH entre los testigos pueden deberse a que Triladyl contiene yema la cual act�a como buffer. Esta al suministrar lipoprote�nas de baja densidad como colesterol y triglic�ridos (Paez et al., 2020), protege a la membra mitocondrial, las mitocondrias al liberar ATP son las responsables del movimiento esperm�tico cualquier da�o compromete la motilidad de los espermatozoides y disminuye su potencial fertilizante (Quispe et al., 2023).

Nuestro estudio tambi�n incluyo a los dilutores Andromed y Ovixcell formulados a base de activos vegetales, estos fueron introducidos a la industria del comercio con el prop�sito de reducir contaminaciones con microorganismos, lo que puede suceder con la yema, pero pese a esto, la adici�n de yema a los dilutores ha demostrado ser m�s efectiva tras la descongelaci�n (Paez et al., 2020).

Los diluyentes usados en nuestro estudio contienen glicerol punto clave ya que, en nuestra investigaci�n se hace menci�n al declive inmediato de la motilidad progresiva en semen fresco reci�n diluido. (Sharafi, 2022) a�ade que el da�o en las c�lulas esperm�ticas suele ser significativa al introducir el agente crioprotector, es decir al inicio y tambi�n al final del proceso, aunque tambi�n puede ocurrir durante las fases de congelaci�n y descongelaci�n a ritmos lentos o moderados.

�Esta situaci�n puede estar relacionada a que este componente es altamente toxico para las c�lulas dependiendo la temperatura y concentraci�n, este da�a la membrana e influye negativamente en su funcionalidad, probablemente porque el glicerol atraviesa la membrana celular cuando se a�ade a 30 �C, en la soluci�n madre, mientras que al ser a�adido el dilutor con glicerol despu�s de ser equilibrado, al encontrarse a una temperatura de 4�C no penetra y disminuye su toxicidad, por lo que es m�nima la p�rdida de espermatozoides antes de la criopreservaci�n (Saha et al., 2022).

En Ecuador se evalu� �nicamente mediante microscopia tradicional, Andromed, Ovixcell y Triladyl donde este �ltimo fue el m�s efectivo sin embargo se discute los resultados post-congelaci�n con Andromed y Ovixcell ya que en nuestro estudio estos diluyentes rotaron, Andromed indicando un declive significativo, suceso que en el estudio de (Pozo, 2015) no pasa. Existen sucesos similares (Fernandes et al., 2021) evidencia a Ovixcell con el valor m�s bajo en semen fresco diluido, pero en post-congelaci�n esto cambia, es curioso el descenso considerable de Andromed indicando alta mortalidad, as� mismo (Mujitaba et al., 2024) evaluaron Andromed, Ovixcell y Bioxcell todos a base de un componente vegetal donde Andromed evidencia el �ltimo lugar, con alta mortalidad.

Estas diferencias pueden deberse a la relaci�n de la disoluci�n, as� lo expone (Ortiz et al., 2022) recalcando que ya se ha mencionado en varios estudios la importancia de manejar adecuadamente proporciones para asegurar la preservaci�n de la estructura y funci�n de las c�lulas, adem�s (Maside et al., 2023) menciona que es imprescindible considerar que los resultados de motilidad pueden llegar a diferir seg�n las condiciones del laboratorio en el que se realiza el estudio, ya que en cuanto a cin�tica el tipo de c�mara de conteo, duraci�n de las grabaciones de video y generalmente el tiempo de incubaci�n, influyen directamente en las mediciones, as� como es probable que sea debido a resultados inexactos por microscopia tradicional (Prochowska et al., 2022) coloca como referencia a las c�lulas que se exponen a condiciones hipoosm�ticas, estas exhiben� variadas formas de hinchaz�n, que van desde un ligero enrollamiento al final de la cola hasta un enrollamiento completo que involucra la pieza intermedia, algunas c�lulas con defectos como colas enrolladas o dobladas en el semen puro pueden parecerse a estos patrones de hinchaz�n, lo que puede llevar a una categorizaci�n incorrecta cont�ndolas como hinchadas.

Sin embrago el declive de los extensores post-congelaci�n a base de componentes vegetales puede estar ligado a la proveniencia, estructura y funci�n de sus fosfol�pidos en su formulaci�n, as� como las variaciones de agentes como el glicerol, tampones o az�cares, pueden afectar las cualidades de estos medios (Saratsi, 2024). La lecitina de soja pese a tener lipoprote�nas similares a las presentes en las membranas de los mam�feros, como la fosfatidilcolina, �cidos grasos oleico, palm�tico y este�rico (Oke & Paliyath, 2010), adem�s de tener menor viscosidad frente a Tris o yema de huevo (Thun et al., 2002), est� probada que no aporta una protecci�n suficiente, lo que al descongelar provoca una viabilidad inferior frente a los dilutores con yema de huevo. (Crespilho et al., 2012).

 

Conclusiones

Al evaluar los extender mediante microscopia tradicional y sistema CASA, los hallazgos evidenciados en esta investigaci�n revelan que el diluyente a base de yema de huevo Triladyl preserva mejor las caracter�sticas funcionales del esperma ovino, adem�s de ser el �nico de los dilutores que conservo su pH inicial de 7 asociado positivamente con la movilidad esperm�tica, este dilutor brinda mayor protecci�n ante las consecuencias que provoca la criopreservaci�n, frente a dilutores a base de fosfol�pidos vegetales, estas revelaciones evidencian un alto potencial para programas de mejoramiento gen�tico, ya que al incluir el sistema CASA nos permiti� una evaluaci�n m�s precisa, adem�s de distinguir y deducir el c�mo y porque var�an las respuestas, lo que proporciona una base m�s s�lida para programas, investigaciones y� practicas futuras de mejoramiento gen�tico en ovinos.

 

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