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Establecimiento in vitro de aguacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemos axilares

 

In vitro establishment of avocado (Persea Americana Mill.) from axillary meristems

 

Estabelecimento in vitro de abacate (Persea Americana Mill.) a partir de meristemas axilares

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Correspondencia: Digna.suatunce8776@utc.edu.ec

 

Ciencias T�cnicas y Aplicadas

Art�culo de Investigaci�n

 

 

* Recibido: 30 de diciembre de 2023 *Aceptado: 03 de enero de 2024 * Publicado: �07 de febrero de 2024

 

        I.            Estudiante de Agronom�a, Universidad T�cnica de Cotopaxi, Latacunga, Ecuador.

      II.            Ingeniero Agr�nomo, M�ster en Biotecnolog�a Molecular y Celular de Plantas, Universidad T�cnica de Cotopaxi, Latacunga, Ecuador.

   III.            Ingeniero Agr�nomo, Mag�ster en Sanidad Vegetal, Universidad T�cnica de Cotopaxi, Latacunga, Ecuador.

   IV.            Ingeniero Agr�nomo, M�ster en Producci�n Hortofrut�cola, Escuela Superior Polit�cnica de Chimborazo, Riobamba, Ecuador.

Resumen

La t�cnica de propagaci�n por cultivo in vitro es una alternativa para la producci�n de plantas a gran escala y libre de enfermedades, conservando las caracter�sticas gen�ticas de la planta madre. El objetivo de esta investigaci�n fue establecer un protocolo de establecimiento in vitro de aguacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemos axilares. Se utilizaron dos ensayos. El primer ensayo consisti� en determinar el mejor protocolo de desinfecci�n para el establecimiento as�ptico de las micro estacas la cual consisti� en diferentes concentraciones de etanol (75 � 95%) e hipoclorito de sodio (3%), en tiempos de inmersi�n variados (1, 5, 10 minutos) y se evaluaron el porcentaje de contaminaci�n y la viabilidad. En un segundo ensayo se realiz� la inoculaci�n de los explantes in vitro en la que se evalu� diferentes medios de cultivo combinando Murashige &vSkoog y Woody Plant Medium con diferentes tipos de fitohormonas (Bencilaminorurina BAP, isopenteniladenina 2iP, �cido indol but�rico IBA), en el que se evaluaron altura de brote, n�mero de brotes por explante y la contaminaci�n polifen�lica. Entre los resultados obtenidos tenemos que las diferencias en los tiempos de inmersi�n en los agentes desinfectantes influyen en el porcentaje de contaminaci�n microbiana de los explantes de partida en la fase de establecimiento. El mejor m�todo de desinfecci�n fue el protocolo D en la que el tiempo de inmersi�n de los explantes en alcohol e hipoclorito de sodio fue de 1 minuto, reportando un 48% de contaminaci�n y una viabilidad de los explantes de un 78%. El mejor promedio en altura de brote se dio al combinar Woody Plant Medium con 0.5 mg/L de 2iP en la que se obtuvo 1.38 cm en promedio, mientras que, los tratamientos WP y MBA obtuvieron los mayores promedios de brotes por explante de 2.1 y 1.95 respectivamente y finalmente el tratamiento MBA el mismo que conten�a carb�n activado y �cido asc�rbico se observ� el m�s bajo porcentaje de contaminaci�n polifen�lica (8%).

Palabras clave: Aguacate; Explantes; In vitro; Meristemos, Micropropagaci�n.

 

Abstract

The propagation technique by in vitro culture is an alternative for the production of large-scale, disease-free plants, preserving the genetic characteristics of the mother plant. The objective of this research was to establish an in vitro establishment protocol for avocado (Persea Americana Mill.) from axillary meristems. Two trials were used. The first test consisted of determining the best disinfection protocol for the aseptic establishment of the micro cuttings, which consisted of different concentrations of ethanol (75 - 95%) and sodium hypochlorite (3%), at varied immersion times (1, 5, 10 minutes) and the percentage of contamination and viability were evaluated. In a second trial, the inoculation of the explants in vitro was carried out in which different culture media were evaluated combining Murashige &vSkoog and Woody Plant Medium with different types of phytohormones (Benzylaminorurin BAP, isopentenyladenine 2iP, Indole butyric acid IBA), in which Shoot height, number of shoots per explant and polyphenol contamination were evaluated. Among the results obtained, we have that the differences in the immersion times in the disinfectant agents influence the percentage of microbial contamination of the starting explants in the establishment phase. The best disinfection method was protocol D in which the immersion time of the explants in alcohol and sodium hypochlorite was 1 minute, reporting 48% contamination and a viability of the explants of 78%. The best average in shoot height was given when combining Woody Plant Medium with 0.5 mg/L of 2iP in which 1.38 cm on average was obtained, while the WP and MBA treatments obtained the highest average of shoots per explant of 2.1 and 1.95 respectively and finally the MBA treatment, the same one that contained activated carbon and ascorbic acid, the lowest percentage of polyphenol contamination was observed (8%).

Keywords: Avocado; Explants; In vitro; Meristems, Micropropagation.

 

Resumo

A t�cnica de propaga��o por cultivo in vitro � uma alternativa para a produ��o de plantas em larga escala e livres de doen�as, preservando as caracter�stica gen�ticas da planta m�e. O objetivo desta pesquisa foi estabelecer um protocolo de estabelecimento in vitro para abacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemas axilares. Foram utilizados dois ensaios. O primeiro teste consistiu em determinar o melhor protocolo de desinfec��o para o estabelecimento ass�ptico das microestacas, que consistiu em diferentes concentra��es de etanol (75 - 95%) e hipoclorito de s�dio (3%), em tempos de imers�o variados (1, 5, 10 minutos) e foram avaliadas a porcentagem de contamina��o e a viabilidade. Em um segundo ensaio, foi realizada a inocula��o dos explantes in vitro, onde foram avaliados diferentes meios de cultura combinando Murashige &vSkoog e Woody Plant Medium com diferentes tipos de fitohorm�nios (Benzilaminorurina BAP, isopenteniladenina 2iP, �cido indol but�rico IBA), em que Shoot foram avaliados altura, n�mero de brotos por explante e contamina��o por polifen�is. Dentre os resultados obtidos, temos que as diferen�as nos tempos de imers�o nos agentes desinfetantes influenciam no percentual de contamina��o microbiana dos explantes iniciais na fase de estabelecimento. O melhor m�todo de desinfec��o foi o protocolo D em que o tempo de imers�o dos explantes em �lcool e hipoclorito de s�dio foi de 1 minuto, relatando 48% de contamina��o e uma viabilidade dos explantes de 78%. A melhor m�dia na altura dos brotos foi dada ao combinar o Woody Plant Medium com 0,5 mg/L de 2iP onde se obteve 1,38 cm em m�dia, enquanto os tratamentos WP e MBA obtiveram a maior m�dia de brotos por explante de 2,1 e 1,95 respectivamente e por fim no tratamento MBA, o mesmo que continha carv�o ativado e �cido asc�rbico, foi observado o menor percentual de contamina��o por polifen�is (8%).

Palavras-chave: Abacate; Explantes; Em vitro; Meristemas, Micropropaga��o.

 

Introducci�n

El aguacate (Persea americana Mill.) es un cultivar originario de Mesoam�rica y Centroam�rica, su fruto es apetecido por su alto valor nutricional. Su distribuci�n est� en las zonas tropicales y subtropicales de todo el mundo (Galindo-Tovar et al., 2008).

A nivel mundial el consumo de aguacate crece a un ritmo del 3% cada a�o; sin embargo, la producci�n no avanza a la par (Gonz�lez et al., 2018), lo que significa una oportunidad para los pa�ses en v�as de desarrollo como Ecuador para suplir dicha demanda.

El aguacatero es una planta multiplicada tradicionalmente de forma sexual (semilla), y en forma asexual por injertos, a pesar de que este m�todo ha dotado de suficiente material, presenta ciertas limitaciones en relaci�n con la disponibilidad de genotipos con alta productividad, una calidad deficiente en sus frutos, la transmisi�n de enfermedades de una generaci�n a otra.

El cultivo in vitro es una alternativa a la propagaci�n convencional y sus diferentes limitantes que esta tecnolog�a presenta, ya que permite multiplicar material vegetal en una forma r�pida en cualquier �poca del a�o, sobre todo se encuentra libre de enfermedades (Ahmed et al., 2001). La t�cnica consiste en utilizar explantes en estado vegetativo, sano, previamente tratado para propiciar su crecimiento en un ambiente controlado de luz, temperatura y humedad relativa. Varios autores reportan cultivares de aguacate establecidos a partir de segmentos nodales ya sea como meristemos axilares o apicales, por v�a de embriog�nesis, varetas y microestacas (Zulfiqar et al., 2009); (Ibarra et al., 2015); (Blanco Anleu, 2017); (Mansoor, 2018); (Akkaya & Dalkili�, 2020); (Diriba et al., 2020); (Z��iga-Ch�vez, 2023); (Abo El-Fadl et al., 2022); (Rodarte Perales, 2023).

La calidad y tipo de explante empleado, m�todo de desinfecci�n en el establecimiento, la asepsia, el medio de cultivo utilizado en las diferentes fases de micropropagaci�n, como tambi�n, las condiciones ambientales de incubaci�n son fundamentales para el �xito de esta t�cnica (Mroginski & Flaschland, 2004).

En Ecuador, los agricultores han venido produciendo cultivos tradicionales en el Callej�n Interandino como la papa, tomate de �rbol, mora y frutales de temporada, que con el pasar de los a�os se han ido convirtiendo en personas dependientes de estos cultivos. Sin embargo, existe otros frutales, como es el caso del aguacate, con un gran potencial para la diversificaci�n agr�cola. Por esta raz�n, el objetivo de este trabajo fue el establecimiento in vitro del cultivo de aguacate (Persea americana Mill.)� con diferentes medios de cultivo, de esta forma presentar a los agricultores una alternativa de cultivo y, sobre todo, material de alta calidad.

 

Materiales y m�todos

Selecci�n y colecta del material vegetal

Se recolectaron meristemos axilares de aguacate en la zona agr�cola de la finca �Malqui Machay� del recinto Malqui, parroquia de Guasaganda del Cant�n La Man�, con una altitud de 1000 msnm. Se seleccionaron ramas vigorosas y sanas del tercio medio de las plantas. Se realizaron cortes del material vegetal de aproximadamente 2 cm a 2.5 cm de longitud, estas microestacas fueron sumergidas en un fungicida y un bactericida (fosetil aluminio + getamicina) para bajar la carga de contaminaci�n del material y enviadas para el ensayo al laboratorio de biotecnolog�a �Vitro Plantas� del cant�n Cevallos.

Ensayo 1: Establecimiento as�ptico de las microestacas

Una vez recolectado y realizado la primera desinfecci�n con fungicida y bactericida son lavados en el laboratorio con agua y jab�n antibacterial. Seguidamente, se sometieron a diferentes protocolos de desinfecci�n con diferentes concentraciones de etanol e hipoclorito de sodio, en tiempos de inmersi�n variados dentro de c�mara de flujo laminar, como se muestra en el cuadro 1. Finalmente, fueron enjuagadas con agua destilada est�ril.

 

Cuadro 1: Protocolos de desinfecci�n de los explantes usados en el establecimiento in vitro de aguacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemos axilares.

Elaborado por: (Suatunce, 2024)

 

Variables evaluadas

Porcentaje de contaminaci�n y viabilidad

Los datos de contaminaci�n y viabilidad se registraron a los 28 d�as de haber realizado el establecimiento. Se contabilizo los explantes contaminados con agentes f�ngicos y/o bacterianos y los explantes que presentaron alguna respuesta de prendimiento o viables.

Ensayo 2: Inoculaci�n de los explantes in vitro

Para la inoculaci�n los explantes fueron cortados con la ayuda de un bistur� en sus extremos la parte necrosada o da�ada por acci�n de los agentes desinfectantes, luego fueron introducidos en frascos de vidrio el cual conten�a 20 ml de diferentes formulaciones de medios de cultivo (Murashige & Skoog, 1962) y Woody Plant Medium (Mccown & Sellmer, 1987) completo, suplementado con diferentes tipos de fitohormonas, como se muestra en el cuadro 2.

 

Cuadro 2: Medios de cultivo utilizados en el establecimiento in vitro de aguacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemos axilares.

Elaborado por: (Suatunce, 2024)

 

Para este segundo ensayo se utiliz� un dise�o completamente al azar DCA con arreglo factorial AxB, D�nde A es el factor Fotoperiodo y B es el factor Medio de cultivo. En cada uno de los tratamientos de los dos ensayos se utiliz� diez repeticiones con dos explantes en cada repetici�n o frasco. Se prob� una diferencia significativa entre los tratamientos con un valor de α de 0.05 en las pruebas de Tukey, utilizando el an�lisis estad�stico de ANOVA con el software Infostat.

 

Variables evaluadas

Altura del brote

Se evalu� a los 28 d�as despu�s de su establecimiento in vitro, utilizando una regla se midi� desde la base del brote hasta su �pice y su valor se registr� en cm.

N�mero de brotes por explante

A loa 28 d�as de haber establecido se contabiliz� el n�mero de brotes por cada explate (microestaca), se analiz� en cada una de sus repeticiones para finalmente sacar un promedio.

 

Contaminaci�n polifen�lica

Con el fin de disminuir el necrosamiento de los explantes se consider� la adici�n de carb�n activado y �cido asc�rbico al medio de cultivo. Se contabiliz� los explantes necrosados y que no presentaron alg�n tipo de respuesta en brotaci�n y en relaci�n al total de explantes se represent� en porcentaje.

 

Resultados y discusi�n

Establecimiento as�ptico de las microestacas

La contaminaci�n microbiana por hongos o bacterias en los explantes son las mayores dificultades a la hora del establecimiento in vitro de cultivares de aguacate (Cort�s-Rodr�guez et al., 2011). La mayor tasa de contaminaci�n se present� utilizando el Protocolo B en la que el tiempo de inmersi�n de los explantes en el alcohol e hipoclorito de sodio fue de 5 y 10 segundos respectivamente, en el cual alcanza valores de hasta 90% de contaminaci�n y como consecuencia la viabilidad de los explantes se ve reducida en un 42%. Si bien es cierto, que el porcentaje de contaminaci�n m�s bajo se logra con el protocolo A con un 26% de contaminaci�n, sin embargo, se puede observar que su viabilidad no supera el 34%. Por consiguiente, consideramos como mejor m�todo de desinfecci�n al protocolo D como se aprecia en la� figura 1, en la que el tiempo de inmersi�n de los explantes en alcohol e hipoclorito de sodio fue de 1 minuto,� reportando un 48% de contaminaci�n y una viabilidad de los explantes de un 78% superiores a los reportados por (Zulfiqar et al., 2009) en las que utilizando NaClO al 0.5% obtuvo valores entre 66 y 72% de contaminaci�n y a los de� (Ibarra et al., 2015) el mismo se�ala que esta variable se vio afectada por la presencia de hongos y bacterias los cuales impidieron el desarrollo favorable de al menos 50 % de los explantes. Sin embargo, (Diriba et al., 2020) reporta datos superiores a los nuestros utilizando etanol 70% por 1 minuto y NaClO al 1% por 5 minutos en la que su contaminaci�n no supera el 10%.�

Figura 1. Porcentaje de contaminaci�n y viabilidad de los explantes utilizados en el establecimiento in vitro de aguacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemos axilares.

 

Elaborado por: (Suatunce, 2024)

 

En la figura 2 se puede observar un explante (microestaca) de aguacate viable (A) es decir que no mostr� ning�n tipo de contaminaci�n y sus yemas mostraron su prendimiento. La figura (B) muestra contaminaci�n microbiana (hongos) tanto en el medio de cultivo como, en sus explantes.

 

Figura 2: Explantes viables (A) y explantes contaminados (B) en el establecimiento in vitro de aguacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemos axilares.

Elaborado por: (Suatunce, 2024)

 

Altura del brote

El mejor promedio en altura de brote se dio al combinar Woody Plant Medium con 0.5 mg/L de 2iP en la que se obtuvo 1.38 cm en promedio como se muestra en el Cuadro 3, cercanos a los mostrados por (Zulfiqar et al., 2009) en los que reporta promedios de 1.56 cm utilizando tambi�n yemas axilares, mientras que al utilizar Murashige & Skoog sin ninguna hormona se obtuvo el promedio m�s bajo 0.28 cm, sin embargo (Diriba et al., 2020) reporta promedios m�s alentadores de 2.10 cm en brotes provenientes de meristemos axilares y cultivados en medios con 0.125 mg/L de IBA + 0.5 mg/L 6-BAP.

 

Cuadro 3: Altura de brote en cm evaluado en el establecimiento in vitro de aguacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemos axilares.

Elaborado por: (Suatunce, 2023)

 

N�mero de brotes

Los reguladores de crecimiento desempe�an un papel fundamental en el desarrollo cualitativo y cuantitativo de los brotes (Prando et al., 2014), como se muestra en el Cuadro 4 la combinaci�n de la hormona 2iP con las sales de Woody Plant Medium del tratamiento WP se obtuvo el mayor promedio de brotes por explante de 2.1, compartiendo el mismo rango con el tratamiento MBA con 1.95 brotes por explate, el mismo que combina Murashige & Skoog con IBA y 6-BAP, a diferencia con el Tratamiento MS que no contiene hormonas adicionadas. Nuestros resultados fueron superiores a los obtenidos por (Diriba et al., 2020) quien reporta promedios de 1.94 brotes por explante, como tambi�n superiores a los publicados por (Mansoor, 2018) quien report� medias que oscilaban entre 0.46 y 1.08

 

Cuadro 4: N�mero de brotes por explante, evaluados en el establecimiento in vitro de aguacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemos axilares.

Elaborado por: (Suatunce, 2024)

 

En la figura 3 se puede evidenciar explantes (microestacas) de aguacate de los cuales se tomaron las variables altura de brote (A) y el n�mero de brotes por explante (B).

Figura 3. Altura de brote (A) y n�mero de brotes por explante (B) en el establecimiento in vitro de aguacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemos axilares.

 

Elaborado por: (Suatunce, 2024)

 

Oxidaci�n Polifen�lica

La contaminaci�n polifen�lica es el necrosamiento de los explantes (microestacas) en los medios de cultivo, para lo cual (Cort�s-Rodr�guez et al., 2011) sugiere adicionar ciertos compuestos antioxidantes como el carb�n activado y �cido asc�rbico en los medios de cultivo para reducir hasta un 70% el proceso de oxidaci�n. Como se muestra en la Figura 4 en nuestro estudio el mayor porcentaje de contaminaci�n polifen�lica se observ� en el tratamiento WP (40%) el cual no conten�a adicionado carb�n activado y �cido asc�rbico en su medio de cultivo; por el contrario, el tratamiento MBA el mismo que conten�a carb�n activado y �cido asc�rbico se observa un bajo porcentaje de contaminaci�n polifen�lica (8%), similares a los datos reportados por (Ibarra et al., 2015) el mismo que menciona que utilizando carb�n activado en los medios de cultivo, la contaminaci�n polifen�lica no rebasa el 7%.

 

Figura 4: Porcentaje de contaminaci�n polifen�lica en el establecimiento in vitro de aguacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemos axilares.

Elaborado por: (Suatunce, 2024)

 

En la figura 5 se puede observar la contaminaci�n polifen�lica en el medio de cultivo (A) y la consecuente muerte de los explantes. Como tambi�n, los explantes necrosados (B) por la oxidaci�n polifen�lica de los mismos.

 

Figura 5: Contaminaci�n polifen�lica en el medio de cultivo (A) y explantes necrosados y oxidados (B) en el establecimiento in vitro de aguacate (Persea americana Mill.) a partir de meristemos axilares.

Elaborado por: (Suatunce, 2024)

 

Conclusiones

Las diferencias en los tiempos de inmersi�n en los agentes desinfectantes influyen en el porcentaje de contaminaci�n microbiana de los explantes de partida en la fase de establecimiento.

El mejor m�todo de desinfecci�n fue el protocolo D en la que el tiempo de inmersi�n de los explantes en alcohol e hipoclorito de sodio fue de 1 minuto, reportando un 48% de contaminaci�n y una viabilidad de los explantes de un 78%.

El mejor promedio en altura de brote se dio al combinar Woody Plant Medium con 0.5 mg/L de 2iP en la que se obtuvo 1.38 cm en promedio����

Los tratamientos WP y MBA obtuviero los mayores promedios de brotes por explante de 2.1 y 1.95 respectivamente.

El tratamiento MBA el mismo que conten�a carb�n activado y �cido asc�rbico se observ� el m�s bajo porcentaje de contaminaci�n polifen�lica (8%).

 

Referencias

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