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Dise�o in silico de primers para el gen GSTM1 en diagn�stico de C�ncer de Pulm�n

 

In silico design of primers for the GSTM1 gene in the diagnosis of lung cancer

 

Desenho in silico de primers para o gene GSTM1 no diagn�stico de c�ncer de pulm�o

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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Correspondencia: https://orcid.org/0000-0001-9601-6071

 

Ciencias de la Salud

Art�culo de Investigaci�n

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* Recibido: 10 de julio de 2023 *Aceptado: 30 de julio de 2023 * Publicado: �31 de agosto de 2023

 

 

 

        I.            Ingeniero Bioqu�mico, Universidad T�cnica de Ambato, Ecuador

      II.            M�dico General, Universidad Internacional del Ecuador, Quito, Ecuador

  III.            M�ster, Magister, Ingeniero, Universidad T�cnica de Ambato, Ecuador

   IV.            M�ster, Ingeniero, Universidad T�cnica de Ambato, Ecuador

 

Resumen

El c�ncer de pulm�n es una de las enfermedades oncol�gicas m�s prevalentes y mortales en todo el mundo. A medida que avanzamos en la comprensi�n de los mecanismos subyacentes de esta enfermedad, es evidente que la detecci�n temprana y precisa es crucial para brindar el tratamiento efectivo.

La familia de enzimas de transferencia de glutati�n (GST) est� involucrada en el metabolismo de una amplia variedad de carcin�genos, incluyendo aquellos que est�n asociados con el c�ncer de pulm�n. El gen GST1 (glutati�n S-transferasa 1) es miembros de esta familia, y su expresi�n se ha relacionado con el riesgo de desarrollar c�ncer de pulm�n.

Los primers in silico son secuencias cortas de ADN que se dise�an para unirse y amplificar regiones espec�ficas de un gen. El objetivo del presente estudio fue dise�ar primers para amplificar de forma precisa la secci�n ubicada entre el ex�n 5 y 7 donde se identific� un polimorfismo de nucle�tido �nico (SNP), cuyos alelos generan susceptibilidad para desarrollar c�ncer de pulm�n.

Los primers fueron dise�ados empleando Primer3Plus y Primer-BLAST y analizados con OligoAnalyzer. De los 10 pares de primers dise�ados, seleccionamos a los dos mejores de acuerdo con el tama�o del amplic�n (148 y 155 pb) y la tendencia a formar d�meros. Con el fin de validar los primers dise�ados se realizaron pruebas de PCR in silico mediante UGENE comprobando que el dise�o de los primers fue exitoso. Se concluy� que fue posible dise�ar y validar primers in silico espec�ficos para el gen GTS1.

Palabras Clave: PCR; Primers; In Silico; C�ncer; Bioinform�tica.

 

Abstract

Lung cancer is one of the most prevalent and deadly cancer diseases worldwide. As we progress in understanding the underlying mechanisms of this disease, it is clear that early and accurate detection is crucial to providing effective treatment.

The glutathione transfer (GST) family of enzymes is involved in the metabolism of a wide variety of carcinogens, including those that are associated with lung cancer. The GST1 gene (glutathione S-transferase 1) is a member of this family, and its expression has been linked to the risk of developing lung cancer.

In silico primers are short DNA sequences that are designed to bind to and amplify specific regions of a gene. The objective of this study was to design primers to accurately amplify the section located between exon 5 and 7 where a single nucleotide polymorphism (SNP) was identified, whose alleles generate susceptibility to develop lung cancer.

Primers were designed using Primer3Plus and Primer-BLAST and analyzed with OligoAnalyzer. Of the 10 primer pairs designed, we selected the best two according to the size of the amplicon (148 and 155 bp) and the tendency to form dimers. In order to validate the designed primers, in silico PCR tests were carried out using UGENE, verifying that the design of the primers was successful. It was concluded that it was possible to design and validate specific in silico primers for the GTS1 gene.

Keywords: PCR; primers; In Silico; Cancer; Bioinformatics.

 

Resumo

O c�ncer de pulm�o � uma das doen�as cancer�genas mais prevalentes e mortais em todo o mundo. � medida que avan�amos na compreens�o dos mecanismos subjacentes desta doen�a, fica claro que a detec��o precoce e precisa � crucial para fornecer um tratamento eficaz.

A fam�lia de enzimas de transfer�ncia de glutationa (GST) est� envolvida no metabolismo de uma ampla variedade de carcin�genos, incluindo aqueles associados ao c�ncer de pulm�o. O gene GST1 (glutationa S-transferase 1) � um membro desta fam�lia e a sua express�o tem sido associada ao risco de desenvolver cancro do pulm�o.

Primers in silico s�o sequ�ncias curtas de DNA projetadas para se ligar e amplificar regi�es espec�ficas de um gene. O objetivo deste estudo foi projetar primers para amplificar com precis�o a se��o localizada entre os �xons 5 e 7 onde foi identificado um polimorfismo de nucleot�deo �nico (SNP), cujos alelos geram suscetibilidade ao desenvolvimento de c�ncer de pulm�o.

Primers foram projetados usando Primer3Plus e Primer-BLAST e analisados ​​com OligoAnalyzer. Dos 10 pares de primers desenhados, selecionamos os dois melhores de acordo com o tamanho do amplicon (148 e 155 pb) e a tend�ncia de formar d�meros. Para validar os primers desenhados, foram realizados testes de PCR in silico utilizando UGENE, verificando se o desenho dos primers foi bem sucedido. Concluiu-se que foi poss�vel desenhar e validar primers in silico espec�ficos para o gene GTS1.

Palavras-chave: PCR; prim�rios; Em s�lico; C�ncer; Bioinform�tica.

Introducci�n

La familia de enzimas de transferencia de glutati�n (GST) se encargan de catalizar la conjugaci�n de la forma reducida de glutati�n (GSH), eliminando as� compuestos electrof�licos end�genos y ex�genos, las reacciones que llevan a cabo son desintoxicaci�n de fase II, aquellos compuestos producidos por el estr�s oxidativo, sustratos ex�genos como medicamentos, productos intermediarios industriales, pesticidas, herbicidas, contaminantes del ambiente y carcin�genos (Dulhunty, Board, Beard, & Casarotto, 2017). Por lo tanto, dichas enzimas tienen la importante funci�n de proteger al organismo vivo contra los efectos da�inos generados por las sustancias t�xicas con las que entra en contacto.

Si existen deficiencias de GST determinadas gen�ticamente, estas provocan diferencias en la desintoxicaci�n de los xenobi�ticos, entre ellos los metabolitos reactivos de los f�rmacos, provocando incapacidad del metabolismo (Dasari, Ganjayi, Oruganti, Balaji, & Meriga, 2017). Por lo tanto, el organismo vivo tendr� un mayor riesgo de toxicidad, exponi�ndose a los xenobi�ticos y drogas, es as� como, el estudio de dichas enzimas es de inter�s para la industria farmac�utica (El-Deek et al., 2021).

El gen GSTM1 codifica un glutati�n S-transferasa perteneciente a la clase �, con funciones de desintoxicaci�n de compuestos electrof�licos, carcin�genos, f�rmacos terap�uticos, toxinas de ambiente y productos del estr�s oxidativo ((NCBI)[Internet], 2021a). Se expresa tanto en el h�gado como en los test�culos, su presencia trae muchos beneficios al individuo, pero al igual que otros genes su deleci�n acarrea posibles enfermedades (T�rkan & Atalar, 2021).

Los SNP�s son los tipos de variaciones en la secuencia de ADN m�s comunes, representan alrededor del 90% de los polimorfismos de ADN en humanos (Abdelhalim et al., 2020). El polimorfismo del gen GST1 afecta principalmente la respuesta de los pacientes a las terapias contra el c�ncer y la desintoxicaci�n contra sustancias qu�micas t�xicas, ya que estas se encargan de metabolizar los f�rmacos. En este gen, la secci�n ubicada entre el ex�n 5 y 7 donde existe un SNP, cuya sustituci�n de una C por una G en la posici�n 534 da como resultado los alelos GSTM1*A y GSTM1*B que poseen una lisina y una asparagina respectivamente en la posici�n 172. Y un tercer alelo GSTM1*0 denominado alelo nulo generado por una deleci�n homocigota, este se considera inactivo, y afecta la actividad enzim�tica generando susceptibilidad a desarrollar c�ncer de pulm�n (Wang, Li, Lin, Song, & Deng, 2016).

Para amplificar el ADN es indispensable la utilizaci�n de secuencias cortas de �cidos nucleicos denominados primers, las ADN polimerasas utilizan dichas secuencias con el fin de agregar los nuevos nucle�tidos a la cadena de ADN existente, la replicaci�n empieza por el extremo 3� terminal del primer el mismo que copia la hebra opuesta (SfI). Por tal motivo, para una PCR exitosa, la amplificaci�n debe ser espec�fica y sensible, lo cual se logra mediante la adici�n de oligonucle�tidos sintetizados qu�micamente y cationes que estabilizan la reacci�n (Gupta, 2019).

Para el an�lisis, dise�o y validaci�n de primers, se dispone de varios enfoques, desde procesos moleculares in vitro hasta la aplicaci�n de potentes algoritmos computacionales (Hendling, Bari�ić, & journal, 2019). En este segundo enfoque, las herramientas bioinform�ticas permiten evaluar las condiciones de dise�o y funcionales de estos, existe un amplio campo para el dise�o de primers in silico, puesto que, este proceso ofrece a los investigadores un entorno de desarrollo �gil, flexible y eficiente, evitando el desperdicio de recursos para cuando se pruebe los primers in vitro (Orozco-Ugarriza, Anaya, & Martinez, 2016).

Utilizamos los programas Primer-Blast y Primer3Plus y efectuamos dos dise�os, en el primero aplicamos los par�metros de dise�o por defecto y otro dise�o con par�metros m�s rigurosos ya que ser�n aplicados en diagn�stico. Se introdujo concentraciones de espec�ficas de cationes divalentes y dNTPs, la f�rmula de la concentraci�n de sal y la tabla de par�metros termodin�micos se seleccion� de acuerdo con (SantaLucia Jr, 1998). Estos primers fueron validados mediante OligoAnalizer para verificar que se cumplan los par�metros de dise�o y verificar la sensibilidad de estos. Verificamos que el producto de la PCR cumpla con los requerimientos y los validamos haciendo una correlaci�n bibliogr�fica.

 

Materiales y m�todos

Con el fin de identificar la relaci�n del gen GSTM1 con el c�ncer de pulm�n se consult� en las bases de datos MalaCards y Harmonizome. En Malacards, se ingres� en el sitio web y se introdujo el nombre de la enfermedad �lung cancer�, una vez generado los resultados en la parte inferior se encontr� la secci�n de genes involucrados, entre los cuales se encontr� el gen de inter�s GSTM1 con su respectiva puntuaci�n.

En la base de datos Harmonizome, se escogi� la b�squeda Gene sets y se introdujo el nombre de la enfermedad �lung cancer�, la plataforma gener� varios resultados sobre los genes involucrados, entre los cuales tambi�n se encontr� el gen GSTM1 con su respectiva puntuaci�n.

Para obtener la secuencia nucleot�dica del gen GSTM1, el cual est� relacionado con el c�ncer de pulm�n, se utiliz� la base de datos GenBank, se ingres� a la web de la base de datos y se introdujo el nombre del gen (GSTM1) en la barra de b�squeda. Se listaron 3 secuencias Refseq, es decir 3 tr�nscritos con c�digo de acceso NM_000561.4, NM_146421.3 y XM_005270782.5. Se escogi� la secuencia NM_000561.4 puesto que era una secuencia curada adem�s de ser la m�s actual a la fecha de consulta. Para determinar la zona de inter�s se realiz� una b�squeda bibliogr�fica sobre los sitios donde aparece el polimorfismo del gen GSTM1. Se consulto en la base de datos de polimorfismos del NCBI y se correlacion� con los alineamientos locales efectuados con la herramienta BLAST.

Una vez que se identific� la zona de inter�s para la amplificaci�n en la secuencia, se procedi� al dise�o de los primers mediante el software Primer-BLAST y Primer3Plus, se ingres� los par�metros de dise�o y se mantuvo los valores por defecto de concentraci�n de cationes monovalentes y divalentes, concentraci�n de dNTPs. Se seleccion� la f�rmula de correcci�n de sal y la tabla de par�metros termodin�micos de acuerdo con lo que indica (BIOSOFT, 2021). Se realiz� el an�lisis de compatibilidad, a trav�s del programa MultiPLX 2.1, en donde se ingres� un archivo .txt con los primers y sus respectivos amplicones, se ingres� los par�metros de c�lculo y se indic� los tipos de primers que se generaron.

Se utiliz� la plataforma OligoAnalyzer, donde se evalu� la formaci�n de d�meros mediante la cuantificaci�n de la energ�a de formaci�n de las reacciones a trav�s de la energ�a libre de Gibbs, as� tambi�n, se efectu� el an�lisis de las caracter�sticas principales de dise�o de los primers. Se introdujo los primers en la casilla destinada para la secuencia de en direcci�n 5� - 3�, el conjunto de par�metros se modific� para qPCR y las concentraciones se mantuvieron por defecto.

Para determinar la especificidad de los primers se utiliz� la herramienta BLAST del NCBI, donde, mediante un alineamiento de la secuencia del primer contra las bases de datos de diferentes organismos, se busc� determinar la especificidad inter-especies e intra-especie, mediante la evaluaci�n de los alineamientos obtenidos.

Finalmente se realiza la validaci�n in silico de la PCR con los primers dise�ados, para lo cual se utiliz� la herramienta para el control de calidad y especificidad Beacon Desing Free Edition. Aqu� se obtuvieron valores de identidad y E-Value presentados en Nucleotide-BLAST. Estos datos se los proces� con Ugene, donde se calcula y presenta, las dificultades que podr�an tener los primers en la PCR, la regi�n amplificada, longitud del amplic�n y la temperatura de annealing (Branco, Choupina, & biotechnology, 2021).

 

Resultados

Las bases de datos que contienen informaci�n sobre enfermedades humanas son un recurso integral de conocimiento sobre genes y prote�nas que permiten identificar relaciones entre entidades biol�gicas, as� como formular hip�tesis novedosas basadas en datos para validaci�n experimental (Rouillard et al., 2016). Estas bases de datos exponen un conjunto de genes importantes relacionados con el c�ncer del pulm�n, entre los cuales se encontr� el gen GSTM1 con una puntuaci�n alta sobre su relaci�n con la enfermedad, estos se muestran en la Tabla 1.

 

Tabla 1. Relaci�n del gen GSTM1 con el c�ncer de pulm�n

 

La secuencia nucleot�dica del Gen GSTM1 es de inter�s debido a que su polimorfismo tiene un posible v�nculo con una mayor susceptibilidad a desarrollar especialmente c�ncer de pulm�n. Se efectu� un dise�o con par�metros modificados a conveniencia con el fin de mejorar la especificidad y sensibilidad de los primers. Se obtuvieron un total de seis pares de primers, dos pares como control y los otros pares de primers para su utilizaci�n en diagn�stico mediante las herramientas se�aladas anteriormente. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2 y 3.

 

Tabla 2. Primers obtenidos con par�metros por defecto de Primer Blast.

 

 

Tabla 3. Primers obtenidos con par�metros por defecto de Primer3Plus.

 

En la tabla 4 y 5 se muestra los primers dise�ados con Primer-Blast y Primer3Plus para diagn�stico, estas presentan las mejores caracter�sticas, tanto any, self, pair any y pair end presentan valores bajos, lo cual indica una baja probabilidad de formar d�meros y esto se ve reflejado en el mejoramiento de la especificidad.

 

Tabla 4. Primers para diagn�stico dise�ados en Primer-Blast.

 

Tabla 5. Primers para diagn�stico dise�ados en Primer3Plus

 

La temperatura de melting (TM) es uno de los par�metros importantes en el dise�o de primers, se obtiene usando el m�todo termodin�mico, que es la forma m�s exacta de calcularla mediante el uso de la entalp�a, entrop�a de formaci�n de la h�lice, la constante de los gases y la concentraci�n de oligonucle�tidos (Berm�dez, 2022). En la tabla 6 se muestran los valores �ptimos de la TM.

 

Tabla 6. Temperatura de melting en primers dise�ados para diagn�stico

Primer-Blast
Primers	Temperatura de melting (ᵒC)
Forward	59,9
Reverse	61,8
Primer3Plus
Primers	Temperatura de melting (ᵒC)
Forward	59,9
Reverse	62,1

 

Para evaluar en n�mero de productos de amplificaci�n que se generan, se analiza la curva de fusi�n. Si la uni�n es espec�fica debe generarse un solo pico estrecho, lo cual indica que se ha generado el ADN diana de inter�s; si genera un pico m�s peque�o a la izquierda puede corresponder a la curva de disociaci�n de los d�meros del primer (Jalali, Zaborowska, & Jalali, 2017).

 

Figura 1.- Curvas de fusi�n para primers de uso diagn�stico calculadas en uMELT. A. Curva de fusi�n del amplic�n formado con primers dise�ados en Primer-Blast. B. Curva de fusi�n del amplic�n formado con primers dise�ados en Primer3Plus

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Las estructuras secundarias resultan de las interacciones entre bases dentro del mismo primer o entre dos primers diferentes, la presencia de estas estructuras en los primers debido a las interacciones intermoleculares o intramoleculares pueden generar un rendimiento del producto de la PCR escaso o nulo lo que afecta negativamente la hibridaci�n primer-molde (Roy, 2019).

Tabla 7. Estructuras secundarias generadas por primers para uso investigativo software Oligoanalyzer

Software	Primer	Hetero dimer		Self dimer		Hairpin
		∆G	Base pairs	∆G	Base pairs	∆G	#
Primer-Blast	Forward	-3,53	3	-6,34	4	-2,39	2
	Reverse			-3,61	2	-1,16	1
Primer3Plus	Forward	-5,47	4	-5,36	4	-1,49	3
	Reverse			-3,61	2	-1,16	1

 

Mediante la validaci�n in silico se comprueba que los componentes de la reacci�n de PCR como primers y sondas de nucle�tidos, esto permite aceptar o rechazar el par de imprimaciones dise�adas (van Weezep, Kooi, & van Rijn, 2019). Los primers presentaron valores aceptables para la Tm, ya que el dise�o se enfoc� en obtener la menor afinidad posible por generar d�meros de primers, es decir obtener una alta especificidad, lo cual se confirm� al procesar la PCR in silico.

 

Figura 2. Amplic�n obtenido mediante PCR in silico con primers dise�ados en Primer-Blast

Tabla 8. Caracter�sticas del producto de PCR en primers para uso diagn�stico dise�ados en Primer-Blast

 

Figura 3. Amplic�n obtenido mediante PCR in silico con primers dise�ados en Primer3Plus

Tabla 9. Caracter�sticas del producto de PCR en primers para uso diagn�stico dise�ados en Primer3Plus

 

Discusi�n

El Gen GSTM1 presenta un SNP, que origina los alelos GSTM1*A y GSTM1*B, por lo tanto, el estudio del polimorfismo del gen GSTM1 es importante, amplificando la zona de inter�s que comprende entre el ex�n 5 y 7 de la secuencia NM_00056 ((NCBI)[Internet], 2021b), esta regi�n abarca la posici�n nucleot�dica 534, con una longitud total de 308 pb que se acot� con los primers dise�ados y se amplifica con la PCR. Hay que se�alar, que los primers dise�ados han sido probados para una PCR in silico convencional, para una qPCR hay que ajustarlos para obtener resultados satisfactorios.

La especificidad de los primers es una de las caracter�sticas m�s importantes para tener en cuenta en el dise�o, esta depende de la longitud y de la TM, si tenemos primers muy peque�os y la TM es muy baja, se generan uniones inespec�ficas (SantaLucia Jr, 1998), en nuestros primers se ha encontrado que la longitud de los pares de primers se encuentra entre 19 y 20 bp y la TM esta entre 48�54 ⁰C. Con este resultado, se debe tener en cuenta que para el dise�o de primers para una qPCR el rango de la TM �ptima se encuentra entre 60 y 64�C con una temperatura ideal de 62�C (Syamsidi, Aanisah, Fiqram, Al Jultri, & Chemistry, 2021). Se aplic� una concentraci�n de 3.5 mM de MgCl₂ lo que aument� ligeramente la TM, con lo que se confirma la influencia del Magnesio en la reacci�n.

Seg�n (Orozco-Ugarriza et al., 2016), las secuencias repetitivas internas podr�an causar uniones inespec�ficas, en los primers dise�ados con Primer-Blas encontramos estas secuencias repetitivas. Para el caso del primer forward generado se encuentran 4 bases continuas de Guanina, estas deben evitarse para evitar la disociaci�n completa de la hebra, lo cual reduce la eficiencia de amplificaci�n (Bustin & Huggett, 2017). Por lo que, estos primers no se recomienda sintetizar para la PCR. Los primers que se dise�aron con Primer3Plus no presentaron este problema.

El desaf�o principal para la amplificaci�n en la PCR es evitar reacciones secundarias que conducen a la formaci�n de productos no espec�ficos (d�meros), ya que estas reacciones reducen la especificidad y sensibilidad de los ensayos (Garafutdinov, Galimova, Sakhabutdinova, & Acids, 2020). Los dos juegos de primers obtenidos presentaron un ∆G bajo, lo que garantiza que no se formen d�meros estables. Las horquillas de extremo 3� con un ∆G mayor a -2 kcal/mol son tolerables. Los primers dise�ados en el software Primer-Blast presentaron horquillas con un extremo 3� m�s corto que el extremo 5�, es decir presentaron horquillas internas con una energ�a libre de Gibbs mayor a -3 kcal/mol por lo que tampoco representa problemas al momento de la reacci�n de PCR. Para el caso de las horquillas formadas por los primers dise�ados en Primer3Plus, el primer forward presenta horquillas internas con un ∆G dentro del rango aceptable, el primer reverse tiene afinidad por formar una sola horquilla formada en el extremo 3� con un ∆G mayor a -2 kcal/mol, siendo tambi�n aceptable.

El resultado de la PCR in silico, muestra que hemos obtenido el amplic�n de inter�s, adem�s, se observa una curva de fusi�n uniforme con un �nico pico estrecho, concluyendo que hay alta especificidad en los primers. Los primers que se han dise�ado cumplen con todos los par�metros de dise�o y especificidad, por lo que, se recomienda su uso para sintetizarlos y realizar la PCR convencional en el diagn�stico del c�ncer de pulm�n.

 

Conclusiones

La secuencia del gen GSTM1 identificada con el id NM_000561.4 se la descarg� de la base de datos Genebank del NCBI (fecha de acceso 20 de Septiembre de 2021), en esta secuencia se identific� un SNP el mismo que sirvi� de gu�a para delimitar la zona de inter�s que dese�bamos amplificar, los primers dise�ados cumplen con los par�metros de dise�o y podr�an ser sintetizados y probados en una PCR convencional. Para procesar una qPCR o qRTPCR se deber�a ajustar los par�metros de acuerdo con las condiciones de la reacci�n.

Se utiliz� software de acceso libre en el presente proyecto, Primer-Blast y Primer3Plus, Oligoanalyzer, Beacon designer free edition y Ugene. Los resultados obtenidos en el presente proyecto se podr�an contrastar con otros resultados obtenidos en otras herramientas para dise�o de primers, en las que se configure las mismas condiciones de dise�o. Estos resultados pueden ser contrastados bibliogr�ficamente para mejorar su validez.

Para complementar el estudio y validar los primers in vitro se deber�an realizar pruebas en una PCR convencional usando muestras de ADN humano con pacientes control y diagnosticados con c�ncer de pulm�n y probar los productos de la PCR mediante electroforesis.

 

Referencias

(NCBI)[Internet], N. C. f. B. I. (2021a). Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

(NCBI)[Internet], N. C. f. B. I. (2021b). Nucleotide [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information; [2021] � . Accession No. NM_000561.4, Homo sapiens glutathione S-transferase mu 1 (GSTM1), transcript;. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000561.4/

Abdelhalim, D. M., Albkrye, A. M., Salih, M. A., Abodlaa, A., Elnasri, H. A., & Khaier, M. A. J. E. J. B. P. S. (2020). In silico analysis of a single nucleotide polymorphism (SNPS) in human GSTM1 gene associated with cancer development. 7(1), 514-521.

Berm�dez, G. P. (2022). Biolog�a molecular: ADN recombinante y sus aplicaciones: Editorial El Manual Moderno.

Branco, I., Choupina, A. J. A. m., & biotechnology. (2021). Bioinformatics: new tools and applications in life science and personalized medicine. 105, 937-951.

Bustin, S., & Huggett, J. (2017). qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. In: Elsevier GmbH.

Dasari, S., Ganjayi, M., Oruganti, L., Balaji, H., & Meriga, B. J. J. D. V. A. R. (2017). Glutathione S-transferases detoxify endogenous and exogenous toxic agents-minireview. 5(5), 00154.

Dulhunty, A. F., Board, P. G., Beard, N. A., & Casarotto, M. G. (2017). Physiology and pharmacology of ryanodine receptor calcium release channels. In Advances in Pharmacology (Vol. 79, pp. 287-324): Elsevier.

El-Deek, S. E., Abdel-Ghany, S. M., Hana, R. S., Mohamed, A. A., El-Melegy, N. T., & Sayed, A. A. J. M. B. R. (2021). Genetic polymorphism of lysyl oxidase, glutathione S-transferase M1, glutathione-S-transferase T1, and glutathione S-transferase P1 genes as risk factors for lung cancer in Egyptian patients. 48, 4221-4232.

Garafutdinov, R. R., Galimova, A. A., Sakhabutdinova, A. R. J. N., Nucleotides, & Acids, N. (2020). The influence of quality of primers on the formation of primer dimers in PCR. 39(9), 1251-1269.

Gupta, N. J. J. o. c. (2019). DNA extraction and polymerase chain reaction. 36(2).

Hendling, M., Bari�ić, I. J. C., & journal, s. b. (2019). In-silico design of DNA oligonucleotides: challenges and approaches. 17, 1056-1065.

Jalali, M., Zaborowska, J., & Jalali, M. (2017). The polymerase chain reaction: PCR, qPCR, and RT-PCR. In Basic science methods for clinical researchers (pp. 1-18): Elsevier.

Orozco-Ugarriza, M. E., Anaya, P. F., & Martinez, Y. O. J. R. R. d. I. A. y. D. S. (2016). VALIDACI�N In silico DE OLIGONUCLE�TIDOS-PRIMERS PARA LA DETECCI�N ESPECIFICA DE Salmonella spp. MEDIANTE REACCI�N EN CADENA DE LA POLIMERASA. 1(1), 42-50.

Rouillard, A. D., Gundersen, G. W., Fernandez, N. F., Wang, Z., Monteiro, C. D., McDermott, M. G., & Ma�ayan, A. J. D. (2016). The harmonizome: a collection of processed datasets gathered to serve and mine knowledge about genes and proteins. 2016.

Roy, D. G. (2019). A new algorithm for primer design. The University of Western Ontario (Canada),

SantaLucia Jr, J. J. P. o. t. N. A. o. S. (1998). A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. 95(4), 1460-1465.

SfI, H. Primers were designed using the Beacon designer� software (Premier Biosoft).

Syamsidi, A., Aanisah, N., Fiqram, R., Al Jultri, I. J. J. o. T. P., & Chemistry. (2021). Primer Design and Analysis for Detection of mecA gene. 5(3), 245-253.

T�rkan, F., & Atalar, M. N. (2021). The toxicological impact of some agents on glutathione S-transferase and cholinesterase enzymes. In Toxicology (pp. 281-290): Elsevier.

van Weezep, E., Kooi, E. A., & van Rijn, P. A. J. J. o. v. m. (2019). PCR diagnostics: In silico validation by an automated tool using freely available software programs. 270, 106-112.

Wang, M., Li, Y., Lin, L., Song, G., & Deng, T. J. M. n. (2016). GSTM1 null genotype and GSTP1 Ile105Val polymorphism are associated with Alzheimer�s disease: a meta-analysis. 53, 1355-1364.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

� 2023 por los autores. Este art�culo es de acceso abierto y distribuido seg�n los t�rminos y condiciones de la licencia Creative Commons Atribuci�n-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional (CC BY-NC-SA 4.0)

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