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Definir el aislamiento de levaduras Saccharomyces SPP desde las bayas de uva para la fermentaci�n de una cerveza

 

Define the isolation of Saccharomyces SPP yeasts from grape berries for the fermentation of a beer

 

Definir o isolamento de leveduras Saccharomyces SPP de bagas de uva para a fermenta��o de uma cerveja

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Correspondencia: mgutierrez@uagraria.edu.ec

 

Ciencias T�cnicas y Aplicadas

Art�culo de Investigaci�n

 

�������� *Recibido: 17 de marzo de 2023 *Aceptado: 27 de abril de 2023 * Publicado: 08 de mayo de 2023

 

        I.            Universidad Agraria del Ecuador, Facultad de Ciencias Agrarias, Carrera de Ingenier�a Agroindustrial, Ecuador.

      II.            Universidad Agraria del Ecuador, Facultad de Ciencias Agrarias, Carrera de Ingenier�a Agroindustrial, Ecuador.

   III.            Universidad Agraria del Ecuador, Facultad de Ciencias Agrarias, Carrera de Ingenier�a Agroindustrial, Ecuador.

Resumen

El presente trabajo est� basado en la investigaci�n descriptiva. Para lo cual tiene por objeto aislar levaduras Saccharomyces a partir del mosto de uva fermentado y se evalu� su aplicaci�n en procesos de fermentaci�n de cerveza. La investigaci�n consta de 5 etapas, en la primera se aisl� ocho cepas de levadura del g�nero Saccharomyces. Para el aislamiento se tomaron muestras de mosto fermentado de uva. Las colonias aisladas se evaluaron en su capacidad de tolerar sulfito utilizando metabisulfito de sodio (600 ppm) y aquellas que toleraron se consideraron representantes del g�nero Saccharomyces. Luego, se hizo una evaluaci�n morfol�gica de las colonias y c�lulas mediante microscop�a �ptica. Seguidamente, las cepas evaluadas se identificaron bioqu�micamente utilizando Kit API ID32. En la segunda etapa se evalu� la capacidad de fermentaci�n de las levaduras aisladas utilizando un medio sint�tico con diferentes fuentes de carbono: glucosa, fructosa, maltosa, lactosa y sacarosa. Los resultados mostraron que las cepas no fermentan lactosa, pero si los dem�s az�cares: glucosa, fructosa y sacarosa. En la tercera etapa se evalu� la capacidad fermentativa de las cepas a diferentes concentraciones de etanol: 2%, 6%, 10%, 14% y 18%v/v. Todas las cepas mostraron una buena capacidad fermentativa a concentraciones de etanol igual o mayor a 10%v/v. La cepa con mayor tolerancia al etanol (14 y 18%v/v) y r�pida fermentaci�n de maltosa fue seleccionada para posteriores ensayos. De las cepas evaluadas se seleccion� la que tuvo las mejores caracter�sticas. La cepa seleccionada (Saccharomyces C8) se evalu� en su capacidad fermentativa usando mosto de malta a diferentes temperaturas, concentraci�n celular y grados plato. Para ello se utiliz� un dise�o factorial completo 23 con tres repeticiones y cuatro puntos centrales. Se determin� tres variables respuestas: producci�n de etanol, productividad de etanol y rendimiento de etanol.

Palabras Claves: Levaduras; Saccharomyces; Fermentaci�n, Cerveza.

 

Abstract

The present work is based on descriptive research. Its objective is to isolate Saccharomyces yeasts from fermented grape must and evaluate their application in beer fermentation processes. The research consists of 5 stages. In the first stage, eight strains of Saccharomyces yeast were isolated from fermented grape must samples. The isolated colonies were evaluated for their ability to tolerate sulfites using sodium metabisulfite (600 ppm), and those that tolerated were considered representatives of the Saccharomyces genus. Morphological evaluation of the colonies and cells was then carried out using optical microscopy. Subsequently, the evaluated strains were biochemically identified using an API ID32 kit. In the second stage, the fermentation capacity of the isolated yeasts was evaluated using a synthetic medium with different carbon sources: glucose, fructose, maltose, lactose, and sucrose. The results showed that the strains do not ferment lactose, but they do ferment the other sugars: glucose, fructose, and sucrose. In the third stage, the fermentative capacity of the strains was evaluated at different ethanol concentrations: 2%, 6%, 10%, 14%, and 18% v/v. All strains showed good fermentative capacity at ethanol concentrations of 10% v/v or higher. The strain with the highest ethanol tolerance (14 and 18% v/v) and rapid maltose fermentation was selected for further experiments. The strain with the best characteristics was selected from the evaluated strains. The selected strain (Saccharomyces C8) was evaluated for its fermentative capacity using malt wort at different temperatures, cell concentrations, and degrees Plato. A complete 23 factorial design with three repetitions and four central points was used. Three response variables were determined: ethanol production, ethanol productivity, and ethanol yield.

Keywords: Yeasts; Saccharomyces; Fermentation, Beer.

 

Resumo

Este trabalho � baseado em pesquisa descritiva. Para o qual se pretende isolar leveduras Saccharomyces do mosto fermentado e avaliar a sua aplica��o em processos de fermenta��o cervejeira. A investiga��o consiste em 5 etapas, na primeira foram isoladas oito linhagens de leveduras do g�nero Saccharomyces. Para o isolamento, foram retiradas amostras de mosto de uva fermentado. As col�nias isoladas foram avaliadas quanto � toler�ncia ao sulfito utilizando metabissulfito de s�dio (600 ppm) e as que toleraram foram consideradas representantes do g�nero Saccharomyces. Em seguida, foi feita uma avalia��o morfol�gica das col�nias e c�lulas por microscopia de luz. Em seguida, as cepas avaliadas foram identificadas bioquimicamente por meio do Kit API ID32. Na segunda etapa, foi avaliada a capacidade fermentativa das leveduras isoladas em meio sint�tico com diferentes fontes de carbono: glicose, frutose, maltose, lactose e sacarose. Os resultados mostraram que as cepas n�o fermentam a lactose, mas os outros a��cares sim: glicose, frutose e sacarose. Na terceira etapa, a capacidade fermentativa das cepas foi avaliada em diferentes concentra��es de etanol: 2%, 6%, 10%, 14% e 18% v/v. Todas as cepas apresentaram boa capacidade fermentativa em concentra��es de etanol iguais ou superiores a 10% v/v. A cepa com maior toler�ncia ao etanol (14 e 18% v/v) e r�pida fermenta��o da maltose foi selecionada para os ensaios subsequentes. Das cepas avaliadas, foi selecionada aquela com as melhores caracter�sticas. A cepa selecionada (Saccharomyces C8) foi avaliada quanto � sua capacidade fermentativa utilizando mosto de malte em diferentes temperaturas, concentra��es celulares e graus plat�. Para isso, foi utilizado um planejamento fatorial completo 23 com tr�s repeti��es e quatro pontos centrais. Tr�s vari�veis ​​de resposta foram determinadas: produ��o de etanol, produtividade de etanol e rendimento de etanol.

Palavras-chave: Leveduras; Saccharomyces; Fermenta��o, Cerveja.

 

Introducci�n

La presente investigaci�n descriptiva se basa en el estudio de nuevas levaduras que tambi�n es el inter�s al cual apuntan los cerveceros artesanales. Las levaduras tipo Saccharomyces pueden ser aisladas de diferentes medios, principalmente de plantas y frutos. Una forma m�s eficaz de poder aislar estas levaduras es cuando con las frutas se elabora un mosto y se deja en fermentaci�n. Cuando la fermentaci�n del mosto inicia, coexisten diferentes g�neros de levaduras y bacterias, pero conforme se desarrolla el proceso fermentativo, el mosto aumenta su concentraci�n en etanol eliminando la mayor�a de las bacterias y levaduras que no toleran este compuesto o su tolerancia es baja. En este medio comienzan a desarrollarse unos pocos microorganismos con alta tolerancia al etanol, entre ellos destacan las levaduras del g�nero Saccharomyces. Las cervezas generalmente tienen un grado alcoh�lico de 5% v/v, pero dentro de lo artesanal, es com�n encontrar cervezas con un mayor contenido de etanol hasta de un 11% que se asemejan al vino. Para estas condiciones es necesario emplear una levadura que tenga una tolerancia de etanol alta. Luego de establecer esta caracter�stica para la levadura, se debe tener en cuenta otros par�metros muy importantes para una cerveza diferenciada. Esta levadura debe ser capaz de fermentar los az�cares presentes en el mosto, principalmente la maltosa que se encuentra en mayor proporci�n (Willaert, 2016). Esta levadura tambi�n debe producir aromas agradables y diferenciados. Esta �ltima caracter�stica es muy valorada al momento de degustar una nueva cerveza.

Una forma de desarrollar nuevas variedades de cerveza es trabajar con diversos tipos de levaduras que aporten nuevos aromas y sabores que incrementen la calidad sensorial. Las cervecer�as artesanales est�n buscando usar levaduras no convencionales para producir cervezas diferenciadas. Una especie que se est� estudiando es Saccharomyces ludwigii con el objetivo de producir cervezas bajas en calor�as y bajo en etanol (Gschaedler, 2017).

Es necesario conocer las caracter�sticas de la nueva levadura en lo que se refiere a par�metros de fermentaci�n de cerveza, como son temperatura, concentraci�n celular, grados plato y pH. El mosto de cerveza trabaja a un rango de pH entre 5.3 y 5,6 y conforme avanza la fermentaci�n va disminuyendo hasta 4,2 (Kunze, 2006). La temperatura de fermentaci�n influye de forma significativa en el producto final, as�, a 4 temperaturas bajas (cervezas lager) se obtiene cervezas ligeras y ofrecen una variedad reducida de aromas, en cambio, a temperaturas m�s elevadas (cervezas ale) se obtiene una gama de aromas m�s diverso. En las cervezas artesanales es preferible trabajar a temperaturas altas debido al ahorro de costos y obtenci�n de sabores y aromas diferenciados. Los grados plato indican la cantidad de s�lidos totales presentes en el mosto y su concentraci�n determina el grado alcoh�lico que se puede obtener luego de la fermentaci�n. Es importante conocer la capacidad de fermentaci�n de la levadura en un medio con diferentes grados plato. La cantidad de levaduras que se emplea determina la velocidad de fermentaci�n, pero es necesario conocer un punto de equilibrio para obtener una buena calidad de fermentaci�n y minimizar costos. Para conocer los par�metros de fermentaci�n de una cepa de levadura, se debe realizar un dise�o de experimentos, donde se busca optimizar las caracter�sticas m�s acertadas de la cepa y evaluar si es apta para llegar al objetivo que se desea lograr. Una forma de desarrollar nuevas variedades de cerveza es trabajar con diversos tipos de levaduras que aporten nuevos aromas y sabores que incrementen la calidad sensorial. Las cervecer�as artesanales est�n buscando usar levaduras no convencionales para producir cervezas diferenciadas. Una especie que se est� estudiando es Saccharomyces ludwigii con el objetivo de producir cervezas bajas en calor�as y bajo en etanol (Gschaedler, 2017). Las levaduras tipo Saccharomyces pueden ser aisladas de diferentes medios, principalmente de plantas y frutos. Una forma m�s eficaz de poder aislar estas levaduras, es cuando con las frutas se elabora un mosto y se deja en fermentaci�n. Cuando la fermentaci�n del mosto inicia, coexisten diferentes g�neros de levaduras y bacterias, pero conforme se desarrolla el proceso fermentativo, el mosto aumenta su concentraci�n en etanol eliminando la mayor�a de bacterias y levaduras que no toleran este compuesto o su tolerancia es baja. En este medio comienzan a desarrollarse unos pocos microorganismos con alta tolerancia al etanol, entre ellos destacan las levaduras del g�nero Saccharomyces.

 

Materiales y m�todos

Recolecci�n y acondicionamiento de la muestra

El aislamiento de levaduras se realiz� a partir de uvas negras (Se tom� una muestra de 1 Kg de uvas negras de mesa). El acondicionamiento se realiz� de la siguiente manera; las bayas de uva negra se trituraron mec�nicamente sin lavar utilizando guantes quir�rgicos de l�tex en un recipiente previamente aseptizado. El mosto conteniendo los orujos se dej� fermentar a temperatura ambiente por diez d�as en un recipiente herm�tico previamente aseptizado, el cual se tap� con un tap�n de algod�n para dejar liberar la presi�n generada por el CO2 durante la fermentaci�n.

 

Aislamiento de colonias

�El aislamiento de levaduras se llev� a cabo utilizando medio de cultivo s�lido de la siguiente composici�n: extracto de malta (15.0 g/L); peptona bacteriol�gica (5.0 g/L); fosfato de amonio (1.0 g/L); glucosa (20.0 g/L) y agar (18.0 g/L). Se prepar� 30 ml de agar, se licu� y se verti� en tres tubos de ensayo y se esteriliz� a 121 �C durante 15 minutos. Luego de la esterilizaci�n, los tubos de ensayo conteniendo medio de cultivo se dejaron enfriar hasta una temperatura de aproximadamente 45�C. Al primer tubo conteniendo aproximadamente 10 ml de medio se a�adi� 100 �L del mosto fermentado, se homogeniz� y luego se tom� 100 �L de medio de este y se adicion� al siguiente tubo de ensayo. De esta manera se hicieron tres diluciones sucesivas. El contenido de cada tubo se verti� en placas Petri sin dejar solidificar y se incubaron a 25 �C por 48 horas. Durante la incubaci�n se observaron el crecimiento de colonias, las cuales sirvieron para continuar con el aislamiento de levaduras Saccharomyces.

 

Evaluaci�n de tolerancia al metabisulfito de sodio

Las colonias aisladas fueron evaluadas en su capacidad de tolerar metabisulfito de sodio (Na2S2O5), el cual tiene actividad microbiana frente a bacterias y levaduras no Saccharomyces. Para ello se utiliz� medio de cultivo l�quido de la siguiente composici�n: extracto de malta (15.0 g/L); peptona bacteriol�gica (5.0 g/L); fosfato de amonio (1.0 g/L); glucosa (20 g/L) y metabisulfito de sodio (600 mg/L). Se prepar� 30 ml de medio y se verti� en tres tubos de ensayo y se esteriliz� a 121 �C por 15 minutos. Luego, los tubos esterilizados se dejaron reposar por 8 horas para permitir la disociaci�n completa del metabisulfito de sodio y obtener el compuesto activo antimicrobiano (SO2). Seguidamente, con un asa de siembra est�ril y en una c�mara de flujo laminar se tomaron asadas de colonias de la superficie de las placas Petri obtenidas en la Secci�n 2.2 y se inocularon en los tubos de ensayo y se incubaron por 2 d�as a 25 �C. Al t�rmino de la incubaci�n se observ� la producci�n de burbujas en los tubos como un indicativo de la actividad fermentativa de levaduras Saccharomyces.

 

Evaluaci�n de la tolerancia al etanol

Las levaduras sobrevivientes al efecto del metabisulfito de sodio (Secci�n 2.3.) fueron sometidas a altas concentraciones de etanol. Las levaduras Saccharomyces t�picamente toleran altas concentraciones de etanol, el cual tiene actividad antimicrobiana. Para ello se utiliz� medio de cultivo de la siguiente composici�n: extracto de malta (15.0 g/L); peptona bacteriol�gica (5.0 g/L); fosfato de amonio (1.0 g/L) y glucosa (20 g/L). Se preparo 30 ml de medio y se verti� en tres tubos de ensayo y se esterilizaron a 121�C por 15 minutos. Luego, a los tubos se adicionaron etanol absoluto hasta alcanzar una concentraci�n del 15% v/v de etanol en una cabina de flujo laminar. Seguidamente cada tubo se inocul� con 100 �L del caldo fermentado sulfitado obtenido en los ensayos de tolerancia al metabisulfito (Secci�n 2.3) y se incub� a 25 �C por 48 horas. Al t�rmino del cultivo se observ� la producci�n de CO2 y turbidez, el cual es indicativo de la actividad de levaduras Saccharomyces.

 

Aislamiento de levaduras Saccharomyces

Las levaduras sobrevivientes a los tratamientos con metabisulfito y etanol fueron cultivadas en medio s�lido de la siguiente composici�n: extracto de malta (15.0 g/L); 32 peptona bacteriol�gica (5.0 g/L); fosfato de amonio (1.0 g/L), glucosa (20 g/L) y agar (18.0 g/L). El medio se esteriliz� a 121 �C por 15 minutos y luego se verti� en placas Petri. Luego se tom� 100 �L de muestra del medio fermentado obtenido en la Secci�n 2.4, y se a�adi� a un tubo de ensayo conteniendo 10 ml agua est�ril y se realiz� 3 diluciones sucesivas en agua destilada est�ril tomando muestras de 100 �L del tubo anterior. Seguidamente, de cada diluci�n se tom� 50 �L y se inocul� as�pticamente con un asa de Drigalsky en las placas Petri conteniendo medio s�lido esparciendo homog�neamente. Las placas Petri se incubaron a 25�C por 48 horas hasta observar el crecimiento de colonias separadas y definidas las cuales posteriormente fueron individualmente inoculadas en tubos de ensayo conteniendo agar inclinado de la misma composici�n e incubadas por 48 horas a 25�C.

 

Evaluaci�n microsc�pica y selecci�n de colonias

�Colonias de levaduras Saccharomyces fueron evaluadas microsc�picamente con la finalidad de verificar su morfolog�a. Para ello cada aislado se sembr� en placas Petri conteniendo medio s�lido de la siguiente composici�n: extracto de malta (15.0 g/L); peptona bacteriol�gica (5.0 g/L); fosfato de amonio (1.0 g/L), glucosa (20 g/L) y agar (18.0 g/L) e incubado a 25�C por 48 horas. Las colonias fueron observadas en un microscopio �ptico a un aumento de 40X y de ellas se seleccionaron ocho al azar para los ensayos posteriores. Las levaduras Saccharomyces seleccionadas fueron mantenidas en refrigeraci�n a 7�C y renovadas cada tres meses.

 

Evaluaci�n de la capacidad fermentativa de az�cares

Las levaduras seleccionadas (ocho en total) fueron evaluadas en su capacidad de fermentar diferentes az�cares: glucosa, fructosa, maltosa, lactosa y sacarosa. Los experimentos se realizaron en medio l�quido de la siguiente composici�n: az�car (20.0 g/L), extracto de levadura (10.0 g/L); peptona bacteriol�gica (5.0 g/L); sulfato de magnesio (0.5 g/L) y fosfato de amonio (1.0 g/L). La fermentabilidad de az�cares se evalu� a trav�s de la producci�n de CO2 utilizando tubos Durham. Para ello se verti� medio de cultivo en tubos de ensayo y seguidamente se colocaron campanas Durham en el interior cuidando en no dejar burbujas de aire dentro de ellas. Luego los tubos se 33 autoclavaron, se dejaron enfriar y cada uno se inocul� con dos asadas de la respectiva levadura. Los tubos inoculados se incubaron a 25�C por 48 horas. La actividad fermentativa se evidenci� mediante la producci�n de CO2 acumulado dentro de las campanas Durham cada 12 horas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

 

Evaluaci�n de la capacidad de fermentaci�n y selecci�n de levadura

La capacidad fermentativa de las levaduras aisladas se evalu� mediante ensayos de fermentaci�n a diferentes concentraciones de etanol. En los ensayos se utiliz� medio de cultivo de la siguiente composici�n: extracto de malta (15.0 g/L); peptona bacteriol�gica (5.0 g/L); fosfato de amonio (1.0 g/L) y glucosa (20.0 g/L). El medio de cultivo se verti� en tubos de ensayo y seguidamente se colocaron campanas Durham dentro de ellas teniendo cuidado en no dejar burbujas de aire. Luego, los tubos de ensayo se esterilizaron, enfriaron y as�pticamente se adicionaron etanol absoluto hasta alcanzar concentraciones de 2%, 6%, 10%, 14% y 18%v/v respectivamente. Posteriormente los tubos de ensayo se inocularon con dos asadas de la respectiva levadura y se incubaron a 25�C por 4 d�as. La intensidad de fermentaci�n en cada caso se evalu� cada 12 horas mediante la observaci�n de producci�n de gas en las campanas Durham. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y la intensidad de fermentaci�n se report� como el promedio de las tres observaciones. A partir de los resultados obtenidos se seleccion� la cepa que present� las mejores caracter�sticas en t�rminos de velocidad de fermentaci�n y poder fermentativo a altas concentraciones de etanol. La capacidad fermentativa y la velocidad de fermentaci�n se determin� de manera cualitativa en base a la intensidad de producci�n de gas observado en las mediciones realizadas.

 

Evaluaci�n bioqu�mica

Para determinar el g�nero y especie de la cepa de levadura seleccionada se realiz� una identificaci�n bioqu�mica m�s completa mediante la utilizaci�n de un kit API. Se utiliz� un el kit API ID 32C que es un test de asimilaci�n de nutriente. Cuenta con 32 celdas distintas de fuente de carbono, cuando la levadura es capaz de asimilar la fuente de carbono de las celdas, forma una aglutinaci�n en el medio dando una reacci�n positiva. El kit tambi�n presenta un pocillo adicional con esculina, para una reacci�n auxiliar en caso el sistema muestre una baja diferenciaci�n entre dos especies. 34 Para realizar el ensayo, la muestra de levadura se diluy� en 3 ml de agua hasta alcanzar una concentraci�n de 2 Macfarl�n, luego se tom� 250 uL de la muestra y se adicion� al medio API ID 32C. Seguidamente se homogeniz� y se adicion� 135 uL a cada celda del API ID 32C, luego se tap� y se coloc� en incubaci�n a 30 �C. Se realizaron evaluaciones de aglutinaci�n luego de 24 y 48 horas. La identificaci�n se realiz� usando el API software (BioM�rieux, manual API ID 32C).

 

Fermentaci�n de mosto de malta en matraces

Propagaci�n de la levadura La cepa de levadura seleccionada en la Secci�n 2.8 fue propagada en mosto de malta de 8�Brix. El medio de propagaci�n fue preparado a partir de un concentrado comercial de mosto de malta usado en la producci�n de cerveza. El mosto se ajust� a 8 �Brix con agua destilada y se pasteuriz� a 105�C por 8 minutos. Luego se verti� 100 mL de mosto en matraces de 250 mL y se inocul� con dos asadas de la levadura seleccionada. La propagaci�n se realiz� en agitaci�n (150 rpm) en un agitador orbital a temperatura ambiente por 48 horas. Luego de la propagaci�n las c�lulas se colectaron mediante centrifugaci�n a 3600 rpm por 10 minutos. Las c�lulas se suspendieron en 5 mL de mosto fresco y se procedi� a determinar la concentraci�n de c�lulas viables utilizando una c�mara de Neubauer y la metodolog�a de tinci�n con azul de metileno (EBC, 1962).

Fermentaci�n de mosto de malta En los experimentos de fermentaci�n, se emple� mosto de malta concentrado (85 �Brix) el cual fue diluido con agua destilada hasta obtener valores determinados. Las variables que se estudiaron fueron concentraci�n de extracto seco (ES) del mosto (14 y 20�P), temperatura (T�) de fermentaci�n (12 y 18�C) y concentraci�n de inoculo (CI) (1x10-6 y 1x10-8 c�lulas/mL) para ver sus efectos en la producci�n, productividad y rendimiento de etanol. Para ello se utiliz� un dise�o factorial completo 23 con 3 repeticiones resultando en total 24 tratamientos. Las fermentaciones se realizaron a condiciones est�ticas y se monitorearon mediante el pH y �Brix. La determinaci�n del 35 etanol producido se llev� a cabo por picnometr�a. El az�car residual se determin� mediante oxidaci�n qu�mica utilizando �cido dinitrosalic�lico (Miller, 1959).

Fermentaci�n de cerveza en biorreactor Los ensayos de fermentaci�n se realizaron en un biorreactor airlift (5L) a las condiciones definidas anteriormente que incluyen extracto seco del mosto, temperatura y densidad celular (Secci�n 2.9.2). El biorreactor estuvo provisto de un sistema de enfriamiento, un tubo interno conc�ntrico, suministro de aire controlado por un rot�metro, un difusor colocado en la parte inferior de material poroso, entradas para electrodos de pH, ox�geno disuelto y toma de muestra. El cultivo en biorreactor se realiz� con un volumen de trabajo de 2.7 L, pH del mosto de 5.5 y flujo de aireaci�n de 0.075 vvm. La cerveza producida se evalu� sensorialmente mediante pruebas afectivas utilizando una escala hed�nica de cinco puntos (1: me desagrada mucho y 5: me agrada mucho). Se evaluaron atributos tales como sabor y aroma utilizando un panel compuesto por 10 jueces no entrenados entre 20 y 25 a�os de edad. Los jueces se seleccionaron en base considerando que no sean bebedores frecuentes o abstemios.

 

 

 

 

 

Resultados y discusi�n

Aislamiento de colonias, tolerancia al metabisulfito y etanol

Se aislaron microorganismos a partir de mosto de uva fermentado. El tiempo de fermentaci�n (10 d�as) influyo en el proceso de selecci�n natural de levaduras. Se ha reportado que las levaduras m�s tolerantes al etanol tales como Saccharomyces sobreviven hacia el final de la fermentaci�n (Albergaria y Arneborg, 2016). Seguidamente, las colonias aisladas se sometieron a la actividad del metabisulfito (600 mg/L), el cual tiene actividad antimicrobiana contra bacterias l�cticas, ac�ticas y levaduras no-Saccharomyces. Se ha reportado que las levaduras Saccharomyces son capaces de tolerar altas concentraciones de sulfito (200.0 mg/L) en comparaci�n con las bacterias l�cticas y ac�ticas y tambi�n levaduras no-Saccharomyces (Miranda et al., 2015). El uso de antimicrobianos se ha realizado desde mucho tiempo atr�s por ejemplo en la producci�n de vinos. Por ejemplo, los tanques de fermentaci�n y utensilios se desinfectan con azufre con la finalidad de eliminar los microorganismos indeseables que pod�an afectar la calidad de los vinos. Posteriormente, las colonias tolerantes al metabisulfito fueron sometidas a la actividad de etanol (15 %v/v). Se ha demostrado que el etanol tiene actividad antimicrobiana debido a que interrumpe la actividad enzim�tica dentro de la c�lula. Las levaduras del g�nero Saccharomyces se caracterizan por tolerar altas concentraciones de etanol y por ello se utiliza en la producci�n de vinos y bioetanol (Lewis, 2010). La presencia de metabisulfito y etanol en un medio de fermentaci�n tiene un efecto sin�rgico mayor que el efecto individual de cada uno. Se ha reportado que la utilizaci�n de metabisulfito de sodio (200 mg/L) y etanol (12 %v/v) result� en la sobrevivencia del 56% de levaduras Saccharomyces en experimentos realizados con un caldo nutritivo-dextrosa para levaduras a 25 �brix, pH de 3,5 y durante un tiempo 15 horas. (Miranda et al., 2015). Al t�rmino de los ensayos de tolerancia al etanol, se obtuvieron colonias de levaduras del g�nero Saccharomyces resistentes al metabisulfito y etanol. Seguidamente se evalu� la morfolog�a de las colonias y c�lulas por microscopia �ptica. Las colonias y c�lulas que presentaron morfolog�as t�picamente relacionadas al g�nero Saccharomyces fueron seleccionadas.

 

Fermentaci�n de az�cares

Las levaduras seleccionadas (ocho cepas) fueron evaluadas en su capacidad de fermentar az�cares tales como: glucosa, maltosa, sacarosa, fructosa y lactosa. Los resultados de fermentaci�n se muestran en la tabla 1. Se ha observado que todas las levaduras aisladas fueron capaces de fermentar glucosa y fructosa monosac�ridos abundantes en jugos de frutas tales como uva, manzana, pera, etc. Sin embargo, las levaduras (C6, C7 y C8) fueron capaces de fermentar s�lo sacarosa (disac�rido presente en el jugo de ca�a de az�car) y maltosa, disac�rido que resulta de la hidr�lisis del almid�n de la cebada. En procesos de fermentaci�n de vinos se desea aquellas levaduras capaces de fermentar principalmente glucosa y fructosa. Por otro lado, en procesos de fermentaci�n de cerveza se desea levaduras capaces de fermentar principalmente maltosa. La capacidad de las levaduras para fermentar disac�ridos se debe a la producci�n de enzimas que rompen enlaces glucos�dicos y liberan monosac�ridos (glucosa, fructosa o galactosa). Asimismo, no se observ� fermentaci�n de lactosa por las levaduras, lo que indica que no fueron capaces de romper el enlace glucos�dico entre glucosa y galactosa. De todas las levaduras evaluadas, C6, C7 y C8 fueron capaces de fermentar la mayor cantidad de az�cares (glucosa, fructosa, sacarosa y maltosa). Ellas mostraron una fermentaci�n intensa a las 24 horas para el caso de glucosa y sacarosa. En el caso de fructosa la mayor fermentaci�n se observ� a la 30 hora de fermentaci�n. La fuerza de fermentaci�n de maltosa fue alta para las tres levaduras Saccharomyces aisladas. Es sabido que las levaduras utilizan los az�cares en base a su grado de complejidad, as� fermentan primero los monosac�ridos, luego los disac�ridos, trisac�ridos y los az�cares m�s complejos (Hunze, 2006).

 

Tabla 1.
Capacidad de fermentaci�n de az�cares por las levaduras seleccionadas.

 

Aparte de la producci�n de gas, la formaci�n de pel�cula sobre la superficie del medio es una caracter�stica importante, ya que est� relacionado con el requerimiento de ox�geno 39 por los microorganismos. De todas las levaduras ensayadas, ninguna fue capaz de formar pel�cula durante el tiempo de fermentaci�n. Adem�s de la producci�n de gas y formaci�n de pel�cula, se ha evaluado la formaci�n de turbidez en los tubos de ensayo, el cual est� asociado a la intensidad de crecimiento de las levaduras. Los resultados de formaci�n de turbidez se muestran en la Tabla 2. Las levaduras C1, C2, C3, C4 y C5 formaron turbidez cuando fueron cultivadas en glucosa y fructosa, lo que est� relacionado con la afinidad por estos az�cares. Las levaduras C6, C7 y C8 formaron turbidez en presencia de glucosa, fructosa y sacarosa, sin embargo, en presencia de maltosa y lactosa no se observ� dicha caracter�stica. La formaci�n de turbidez, el cual es un indicativo del crecimiento celular est� relacionada con el metabolismo del az�car y otros nutrientes, entre ellos, los amino�cidos y ox�geno. El agotamiento de este �ltimo conduce al detenimiento del crecimiento.

 

Tabla 2.
Formaci�n de turbidez por las levaduras en fermentaciones con diferentes az�cares.

 

Capacidad fermentativa en presencia de etanol

Los resultados de la capacidad fermentativa de las levaduras a diferentes concentraciones de etanol se muestran en la Tabla 3. Se observ� que las levaduras C1, C2, C3, C4 y C5 fueron capaces de fermentar en presencia de concentraciones de etanol de 2 y 6%v/v evaluados en 3 d�as. Sin embargo, concentraciones mayores (10, 14 y 18%v/v) inhibieron la actividad fermentativa. Se ha reportado que el etanol afecta primero la capacidad de fermentar de las levaduras y posteriormente su viabilidad. As� altas concentraciones detienen la actividad enzim�tica paulatinamente deteniendo toda actividad metab�lica lo que conduce a su muerte. Por otro lado, las levaduras C6, C7 y C8 mostraron una capacidad de fermentar a 10, 14 y 18%v/v de etanol. Un aspecto 40 resaltante es que la levadura control (Saccharomyces pastorianus SafLager W-34/70) no fue capaz de fermentar a 18%v/v de etanol hacia el 4to d�a de fermentaci�n. De las levaduras con capacidad de fermentar a 10, 14 y 18%v/v de etanol la cepa C6 mostr� mejores caracter�sticas. Desde el punto de vista de producci�n de vinos y cervezas, levaduras capaces de fermentar a altas concentraciones de etanol son requeridas ya que permite obtener bebidas con diferentes grados alcoh�licos. Est� reportado que levaduras no-Saccharomyces no son capaces de tolerar altas concentraciones de etanol y se inhiben r�pidamente a medida que la concentraci�n aumenta. Miranda et al. (2015), evaluaron la capacidad fermentativa de levaduras Saccharomyces que aislaron a partir de mosto de uva, encontrando que fermentaron con normalidad a una concentraci�n de 12% de etanol. Por otro lado, Guzm�n (2012), evalu� el efecto de diferentes concentraciones de etanol (10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 %v/v) sobre la viabilidad de tres cepas de levaduras Saccharomyces spp., nativas. Los resultados mostraron que la viabilidad celular disminuye a medida que aumenta la concentraci�n de etanol desde 18, 20 y 22%v/v durante 24 horas. La capacidad de fermentar a altas concentraciones de etanol est� relacionada con la su tolerancia a este compuesto, el cual desestabiliza la membrana celular y la presencia de algunas prote�nas y amino�cidos como la prolina (Lewis, 2010; Venegas et al., 2012).

 

Tabla 3.
Capacidad fermentativa de levaduras a diferentes concentraciones de etanol.

 

Adicionalmente se evalu� la formaci�n de turbidez por las levaduras aisladas (Tabla 4). Los resultados mostraron la formaci�n de turbidez tenue en todos los ensayos realizados a una concentraci�n de etanol de 2%v/v. La turbidez est� relacionada con el crecimiento 41 celular y la utilizaci�n de la fuente de carbono como fuente de energ�a. As�, una concentraci�n de etanol del 2%v/v no mostro detener el metabolismo energ�tico fundamental para el crecimiento celular. Por otro lado, s�lo las levaduras C6, C7 y C8 produjeron turbidez tenue a una concentraci�n de etanol del 6%v/v, lo que indica que fueron capaces de crecer lentamente. Con respecto a los ensayos a concentraciones de etanol de 10, 14 y 18% v/v, ninguna levadura, incluyendo el control fueron capaces de formar turbidez.

 

Tabla 4.
Formaci�n de turbidez por levaduras cultivadas a diferentes concentraciones de etanol.

 

Evaluaci�n bioqu�mica

Para la identificaci�n de la cepa seleccionada (C8) se us� el kit API ID 32C. El cultivo fresco de la levadura se inocul� en las celdas del kit que contiene 25 compuestos qu�micos diferentes. Se incub� durante 24 horas y el resultado se interpret� mediante el software API web. La levadura se identific� como Saccharomyces cereviciae. La tabla 5 muestra el resultado obtenido.

 

Tabla 5.
Identificaci�n bioqu�mica de la levadura seleccionada mediante el KIT API ID 32C.

 

Fermentaci�n de mosto de malta en matraces

A partir de los resultados de fermentabilidad de az�cares y capacidad de fermentaci�n a diferentes concentraciones de etanol se seleccion� la levadura C8. Seguidamente se realizaron ensayos de fermentaci�n utilizando mosto de malta comercial. Se evaluaron el efecto de la temperatura, extracto seco y concentraci�n celular sobre la producci�n, rendimiento y productividad de etanol. La matriz experimental del dise�o factorial 23 con tres repeticiones y cuatro puntos centrales que incluye las respuestas de los respectivos tratamientos se muestra en la Tabla 6. Los datos fueron procesados utilizando el programa Design Expert 10.1. Como se muestra, los valores de producci�n de etanol estuvieron entre 24,8 y 49,9 g etanol/L, productividad de etanol est�n entre 0,073 y 0,191 g etanol/L.h y de rendimiento de etanol est�n entre 0,24-0,43 g.etanol/g.az�car. Si bien estos datos representan el rango de cada variable respuesta correspondiente a la zona de experimentaci�n, es necesario determinar la mejor combinaci�n de los valores de las variables independientes que permita obtener los valores m�ximos de producci�n, rendimiento y productividad de etanol.

 

Tabla 6.
Matriz experimental del dise�o factorial completo. Con 3 repeticiones y 4 puntos centrales. Resultados en producci�n de etanol y rendimiento

 

 

 

 

 

 

 

 

Producci�n de etanol

Se analiz� la producci�n �ptima de etanol mediante un an�lisis estad�stico combinando las variables de temperatura, concentraci�n celular y grados plato (�P). Los datos obtenidos mediante ANOVA muestran que el modelo es significativo (Tabla 7) debido a que el valor-p es menor a 0.05. En la tabla tambi�n se observa que los factores del modelo A, B, C, AB, AC, BC y ABC tienen un valor-p menor a 0.05 lo cual indica que son significativos para la determinaci�n del an�lisis de la producci�n �ptima de etanol.

 

Tabla 7.
An�lisis de varianza para la producci�n de etanol.

 

A partir del an�lisis de datos, se gener� una ecuaci�n emp�rica que relaciona la variable respuesta y las independientes, el cual para la producci�n de etanol se expresa en t�rminos de la siguiente ecuaci�n lineal: Producci�n de etanol = 58.79510 + 1.98867 T� - 7.20115 ES - 1.20599x10-6 CI + 0.549500 T�xES + 7.11504x10-8 T�xCI + 8.87565x10-8 ESxCI - 0.309264 T�2 -5.09231x10-9 T�xES x CI. Los valores de R2 = 0.98 y R2 ajustado = 0.97, indican un buen ajuste de los datos a la ecuaci�n encontrada. El efecto de las variables independientes sobre la producci�n de etanol se observa en la Figura 2. As�, el incremento de la temperatura de fermentaci�n y el contenido de extracto seco incrementa la producci�n de etanol (Figura 2a). Esto se debe a que, a mayor contenido de az�cares fermentables en el mosto hay una mayor producci�n de etanol 45 siempre y cuando la levadura sea capaz de producir una mayor cantidad de etanol. Por otro lado, a mayor temperatura una mayor actividad de la levadura lo que favorece la producci�n de etanol. Se observa adem�s un efecto combinado entre ambas variables los cuales se comportan directamente proporcional a la producci�n de etanol. Con respecto a la concentraci�n inicial de c�lulas, se observa un efecto positivo al incrementar dicha concentraci�n (Figura 2b). De igual modo, se observa un efecto combinado con el contenido de extracto seco del mosto, es decir, al incrementar tanto la concentraci�n de c�lulas y az�cares fermentables, la producci�n de etanol incrementa. Adicionalmente se observ� un efecto combinado d�bil de la temperatura y la concentraci�n de c�lulas en la producci�n de etanol dentro de los rangos ensayados (Figura 2c). Esto se debe a que en la producci�n de etanol el contenido de extracto seco tiene un mayor efecto debido a que est� relacionado con el contenido de az�cares fermentables en el mosto y la temperatura es un catalizador de reacciones enzim�ticas celulares. La levadura Saccharomyces cerevisiae fue aislada de una fermentaci�n espont�nea a temperatura ambiente. Todas las levaduras fermentan mejor mientras se incrementa la temperatura hacia el valor �ptimo, pero se debe tener en cuenta un factor importante que es la producci�n de compuestos vol�tiles tales como: diacetilo, alcoholes superiores y �steres. Estos compuestos se producen en mayor cantidad cuando se incrementa la temperatura de fermentaci�n, por ello se experiment� con una temperatura m�xima de 18 �C que est� dentro del rango de las levaduras de fermentaci�n alta. Por otro lado, mientras m�s az�cares disponibles haya en el mosto, se va a producir mayor cantidad de etanol siempre y cuando tambi�n haya nutrientes para el desarrollo de las c�lulas. A una mayor concentraci�n de c�lulas, se aprovecha todos nutrientes disponibles y se maximiza la producci�n de etanol. En nuestros resultados las levaduras aprovecharon las mejores condiciones de cada factor para una mayor producci�n de etanol.

Figura 2. Planos de contorno que muestran el efecto del extracto seco y temperatura (a), extracto seco y concentraci�n celular (b) y, temperatura y concentraci�n celular (c) en la producci�n de etanol.

 

Adicionalmente, con los resultados obtenidos (Tabla 6) se ha procedido a la optimizaci�n de la producci�n de etanol, y se presentan como gr�ficos de Superficie de Respuesta (Figura 3). Los par�metros que conducir�an a la producci�n m�xima de etanol (51.060 g/L) de acuerdo con la optimizaci�n realizada con el software Design Expert ser�an, temperatura 18�C, extracto seco 20�Plato y 108 c�lulas/ml respectivamente. La producci�n de etanol est� influenciada principalmente por la cantidad de az�cares fermentables en el mosto (maltosa). La producci�n de cerveza se realiza por lo general con mostos de 9� Plato para alcanzar el contenido alcoh�lico comercial (4.5 %v/v de etanol). Mostos con mayores contenidos de extracto seco implica una mayor cantidad de maltosa que ser� convertido en etanol y otros componentes. La capacidad de la levadura para fermentar a mayores gravedades espec�ficas y producir mayores cantidades de etanol es deseable desde el punto de vista tecnol�gico. Los resultados mostraron que el incremento de la producci�n de etanol est� relacionado con una mayor concentraci�n de extracto seco (Figura 3 a,b), mayor concentraci�n de inoculo (Figura 3b). Por el contrario, el incremento de la temperatura tendr�a poco efecto en una mayor producci�n de etanol (Figura 3c).

 

Figura 3. Gr�ficos de Superficie de Respuesta de fermentaciones realizadas con la levadura Saccharomyces cerevisiae C8 a diferentes condiciones. Efecto de la temperatura y extracto seco (a), extracto seco y concentraci�n de inoculo (b) y, temperatura y concentraci�n celular (c) en la producci�n de etanol.

 

Conclusiones

� Se aislaron ocho cepas de levaduras con caracter�sticas com�nmente observadas en Saccharomyces tales como tolerancia al etanol (12%v/v) y al metabisultifo de sodio (200 mg/L). Asimismo, se evaluaron morfol�gicamente mostrando formas redondas y elipsoidales t�picamente del g�nero Saccharomyces.

� Todas las cepas aisladas (08) fueron capaces de fermentar glucosa mientras que s�lo tres (C6, C7 y C8) fueron capaces de fermentar adem�s sacarosa y maltosa. Levaduras capaces de fermentar un mayor espectro de az�cares son deseadas.

Adicionalmente, las cepas aisladas no fueron capaces de fermentar lactosa.

� Las cepas C6, C7 y C8 fueron capaces de fermentar en medios conteniendo hasta 18%v/v, caracter�stica adecuada para procesos de producci�n de etanol. De las tres cepas, se eligi� la cepa 8 para los ensayos de fermentaci�n de cerveza.

� La producci�n de etanol durante la fermentaci�n de cerveza estuvo influenciada por la temperatura, el extracto seco del mosto y la concentraci�n inicial de inoculo.

As�, al incrementar la temperatura de fermentaci�n, la cantidad de az�cares fermentables y la densidad celular inicial se incrementa la producci�n de etanol.

� Con respecto a la productividad de etanol, el incremento de la temperatura y la concentraci�n inicial de inoculo tiene efecto positivo. Sin embargo, el extracto seco del mosto tuvo poco efecto. Esto se deber�a a que a mayor cantidad de c�lulas la conversi�n de az�cares a etanol es m�s r�pido y, por otro lado, el incremento de la temperatura acelera los procesos bioqu�micos de las levaduras.

� Los ensayos de fermentaci�n realizados en biorreactor resultaron en valores de producci�n de etanol menores a lo observado en fermentaciones realizadas en matraces. Esto se deber�a al suministro de ox�geno, el cual debi� desviar la conversi�n de etanol hacia la formaci�n de biomasa.

 

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