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Evaluaci�n del perfil de amino�cidos de una premezcla de polvo de arveja (Pisum Sativum) y avena (avena sativa)

 

Evaluation of the amino acid profile of a premix of pea powder (Pisum Sativum) and oats (avena sativa)

 

Avalia��o do perfil de amino�cidos de uma pr�-mistura de p� de ervilha (Pisum Sativum) e aveia (avena sativa)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Correspondencia: cpaz@uagraria.edu.ec

 

 

Ciencias T�cnicas y Aplicadas

Art�culo de Investigaci�n

 

* Recibido: 23 de septiembre de 2022 *Aceptado: 27 de octubre de 2022 * Publicado: 01 de noviembre de 2022

 

 

        I.            Universidad Agraria del Ecuador, Guayaquil, Ecuador.

     II.            Universidad Agraria del Ecuador, Guayaquil, Ecuador.

 

 

 

 

Resumen

En Ecuador la desnutrici�n es un problema latente en ni�os y adolescentes con un �ndice del 15 % al 19,1 %, y en adultos con un �ndice del 1,9 %. Varios estudios se han enfocado en disminuir este �ndice, siendo entre los m�s importantes el desarrollo de mezclas de alimentos vegetales que contengan amino�cidos completos. En esta investigaci�n se desarrollaron tres formulaciones utilizando un cereal (avena) y una leguminosa (arveja), con el fin de crear una mezcla que contenga los amino�cidos esenciales. Las formulaciones se realizaron considerando las siguientes proporciones (arveja:avena, respectivamente), F1: 40:60, F2: 50:50, y F3: 60:40. Se les evalu� el contenido de prote�nas y posteriormente se realiz� un an�lisis estad�stico para seleccionar la formulaci�n de mayor contenido proteico. El dise�o experimental se realiz� considerando un factor, tres tratamientos y 5 repeticiones, donde, el factor era la proporci�n arveja:avena. Como resultado del dise�o experimental se obtuvo que la formulaci�n 1 tuvo el mayor contenido proteico y con ello se determin� el perfil de amino�cidos presentando valores en g AA/ 100 g muestra; His 0,30, Ile 0,45, Leu 0,86, Lys 0,76, Met 0,19, Cys 0,49, Phe 0,60, Tyr 0,52, Thr 0,44, Trp 1,27, Val 0,57 y un an�lisis microbiol�gico para validar su consumo. Se concluye que la formulaci�n 1 cumpl�a con el perfil de amino�cidos esenciales propuesto por la FNB/IOM y la FAO para ni�os de 1 a 3 a�os, adolescentes y adultos, exceptuando lactantes. Adicionalmente, los resultados microbiol�gicos indicaron que la premezcla es apta para el consumo humano.

Palabras claves: Amino�cidos; Arveja; Avena; Prote�nas.

 

Abstract

In Ecuador, malnutrition is a latent problem in children and adolescents with a rate of 15% to 19.1%, and in adults with a rate of 1.9%. Several studies have focused on reducing this index, one of the most important being the development of vegetable food mixtures that contain complete amino acids. In this research, three formulations were developed using a cereal (oats) and a legume (pea), in order to create a mixture containing essential amino acids. The formulations were made considering the following proportions (pea:oats, respectively), F1: 40:60, F2: 50:50, and F3: 60:40. Their protein content was evaluated and subsequently a statistical analysis was performed to select the formulation with the highest protein content. The experimental design was carried out considering one factor, three treatments and 5 repetitions, where the factor was the pea:oat ratio. As a result of the experimental design, it was obtained that formulation 1 had the highest protein content and with it the amino acid profile was determined, presenting values ​​in g AA/100 g sample; His 0.30, Ile 0.45, Leu 0.86, Lys 0.76, Met 0.19, Cys 0.49, Phe 0.60, Tyr 0.52, Thr 0.44, Trp 1.27, Val 0.57 and a microbiological analysis to validate its consumption. It is concluded that formulation 1 complied with the profile of essential amino acids proposed by the FNB/IOM and the FAO for children from 1 to 3 years of age, adolescents and adults, except infants. Additionally, the microbiological results indicated that the premix is ​​suitable for human consumption.

Keywords: Amino acids; Vetch; Oatmeal; Proteins.

 

Resumo

No Equador, a desnutri��o � um problema latente em crian�as e adolescentes com taxa de 15% a 19,1% e em adultos com taxa de 1,9%. V�rios estudos t�m focado na redu��o desse �ndice, sendo um dos mais importantes o desenvolvimento de misturas alimentares vegetais que contenham amino�cidos completos. Nesta pesquisa, foram desenvolvidas tr�s formula��es utilizando um cereal (aveia) e uma leguminosa (ervilha), a fim de criar uma mistura contendo amino�cidos essenciais. As formula��es foram feitas considerando as seguintes propor��es (ervilha:aveia, respectivamente), F1: 40:60, F2: 50:50 e F3: 60:40. O teor de prote�na foi avaliado e posteriormente foi realizada uma an�lise estat�stica para selecionar a formula��o com o maior teor de prote�na. O delineamento experimental foi realizado considerando um fator, tr�s tratamentos e 5 repeti��es, onde o fator foi a rela��o ervilha:aveia. Como resultado do delineamento experimental, obteve-se que a formula��o 1 apresentou o maior teor de prote�na e com ela foi determinado o perfil de amino�cidos, apresentando valores em g AA/100 g amostra; His 0,30, Ile 0,45, Leu 0,86, Lys 0,76, Met 0,19, Cys 0,49, Phe 0,60, Tyr 0,52, Thr 0,44, Trp 1,27, Val 0,57 e uma an�lise microbiol�gica para validar seu consumo. Conclui-se que a formula��o 1 atendeu ao perfil de amino�cidos essenciais proposto pela FNB/IOM e pela FAO para crian�as de 1 a 3 anos, adolescentes e adultos, exceto lactentes. Al�m disso, os resultados microbiol�gicos indicaram que a pr�-mistura � adequada para consumo humano. Palavras-chave: Amino�cidos; Ervilhaca; Aveia; Prote�nas.

 

Introducci�n

La Organizaci�n de las Naciones Unidas para la Alimentaci�n y la Agricultura (FAO) define la malnutrici�n como una condici�n fisiol�gica anormal que resulta del consumo insuficiente, excesivo o desequilibrado de macronutrientes que proveen energ�a (hidratos de carbono, prote�nas y grasas) y micronutrientes (vitaminas y minerales) que son esenciales para el crecimiento y el desarrollo cognitivo de una persona (Organizaci�n de las Naciones Unidas para la Alimentaci�n y la Agricultura, 2014). La malnutrici�n se divide en tres tipos: desnutrici�n, deficiencia de micronutrientes, sobrepeso y obesidad ((Organizaci�n Mundial de la Salud [OMS], 2020).�����

De acuerdo con la FAO (2011), la desnutrici�n es causada por el consumo insuficiente de alimentos que proveen macronutrientes (carbohidratos, prote�nas, grasas) para satisfacer las necesidades de energ�a alimentaria. As� como tambi�n, puede originarse por la mala absorci�n de nutrientes como consecuencia de una enfermedad infecciosa (Agencia de la ONU para los refugiados, 2018). La importancia de la prote�na en la dieta se debe a su capacidad de aportar amino�cidos esenciales para la s�ntesis de prote�na corporal y su incremento durante el crecimiento. Cuando el aporte de amino�cidos es excesivo, el organismo lo utiliza como fuente energ�tica (Hern�ndez, 2005). Una limitaci�n en el aporte de energ�a o prote�na conduce a un retraso en el crecimiento conocido como desnutrici�n. En el adulto, la p�rdida de prote�na se asocia con numerosas alteraciones patol�gicas y a un aumento en la mortalidad (Mart�nez y Mart�nez, 2006).

El ser humano necesita de veinte amino�cidos de los cuales once de ellos el organismo los sintetiza, estos se denominan amino�cidos no esenciales. Por otra parte, los nueve amino�cidos restantes conocidos como esenciales no pueden ser sintetizados por el organismo y deben suministrarse mediante la dieta por medio de las prote�nas (Mataix, 2013). La calidad de una prote�na est� principalmente determinada por dos factores: digestibilidad y la composici�n de amino�cidos esenciales de la prote�na (Institute of Medicine of the National Academies, 2005). Una prote�na que contenga todos los amino�cidos esenciales en concentraciones adecuadas, se denomina prote�na de alto valor biol�gico o prote�na completa (Cervera, Clap�s y Rigolfas, 2004; Mart�nez y Mart�nez, 2004).

Generalmente, las prote�nas de alto valor biol�gico se obtienen de alimentos de origen animal, dado que las prote�nas de origen vegetal carecen de uno o m�s amino�cidos o contienen amino�cidos que se encuentran en menor cantidad. Esta deficiencia del amino�cido en la prote�na se conoce como amino�cido limitante (Cervera et al., 2004). Un alimento con amino�cido limitante no es deseado porque restringe la absorci�n completa del resto de amino�cidos en el organismo (Institute of Medicine of the National Academies, 2005; Cervera et al., 2004).

En Ecuador, la desnutrici�n es un problema que no se ha conseguido erradicar desde 1993 (Quiroz et al., 2020). De acuerdo con el informe emitido por la Organizaci�n de las Naciones Unidas (ONU) correspondiente al a�o 2018, en los �ltimos tres a�os el 7,8 % de los habitantes padecen de desnutrici�n, aconteciendo como principal causa el desbalance en la dieta diaria por el bajo consumo de carnes, frutas y legumbres (Saltos, 2019). Conforme a la �ltima Encuesta Nacional de Salud y Nutrici�n (ENSANUT) realizada en el a�o 2013, el 25,3 % de la poblaci�n preescolar (0 � 5 a�os) padece de desnutrici�n cr�nica (baja estatura para la edad), porcentaje que se ha mantenido hasta la actualidad y que se prev� un incremento del 27 % como consecuencia del COVID-19 (Zambrano, 2020).

La misma situaci�n acontece en la poblaci�n escolar (5 � 11 a�os) y adolescente (12 � 19 a�os) atribuy�ndose un �ndice de desnutrici�n del 15 % y 19,1 % respectivamente. Por otra parte, el 1,9 % de los adultos (20 - 60 a�os) padecen de desnutrici�n aguda (bajo peso para la edad) (Freire et al., 2013). Varios estudios acerca de mezclas de alimentos vegetales aminoac�dicamente completos se han realizado con el fin de disminuir problemas de desnutrici�n, promover el consumo de alimentos vegetales u ofrecer alternativas diferentes a las comunes como los alimentos de origen animal.

Santill�n (2018) en su trabajo de investigaci�n, menciona que una correcta formulaci�n de mezclas a partir de cereales y leguminosas puede llegar a aportar la misma cantidad de amino�cidos esenciales que un kilogramo de carne de res. El estudio se orient� en encontrar la mejor combinaci�n de cereal: leguminosa (en base a la calidad aminoac�dica) de 144 mezclas alimenticias utilizando 4 tipos de cereales y 4 tipos de leguminosas, con el objetivo de disminuir los �ndices de desnutrici�n infantil. Los cereales considerados para realizar las mezclas fueron: arroz (Oryza sativa), trigo (Triticum aestivum), avena (Avena sativa) y ma�z (Zea mays); y las leguminosas: chocho (Lupinus mutabilis), arveja (Pisum sativum), lenteja (Lens culinaris) y frijol (Phaseolus vulgaris).

Coila (2020) explica que en la actualidad las personas prefieren una alimentaci�n vegetariana, sin embargo, la calidad proteica no es �ptima para reemplazar los alimentos de origen animal. Por esa raz�n, mediante el m�todo PDCAAS (Puntuaci�n de amino�cidos corregida por la digestibilidad) y la optimizaci�n con Design Expert, determin� el aporte aminoac�dico de varias combinaciones entre granos andinos, cereales y leguminosas. Los factores que fueron considerados para la selecci�n de los alimentos en el estudio fueron la composici�n qu�mico proximal, el contenido de amino�cidos esenciales y el factor de digestibilidad. Los alimentos seleccionados fueron: tarwi, arroz, ca�ihua, avena, quinua, kiwicha (amaranto), ma�z, soya, lenteja, garbanzo y haba.

En este contexto de la investigaci�n, se busca formular una premezcla tipo suplemento con el fin de proporcionar prote�nas de alto valor biol�gico mediante la combinaci�n de un cereal (avena) y una leguminosa (arveja) para ser ofertado como una alternativa diferente a los productos con contenido proteico ya existentes.

Las prote�nas tienen la capacidad de complementarse entre s�, al mezclar prote�nas de alto y bajo valor biol�gico, o prote�nas de bajo valor biol�gico con distintos amino�cidos limitantes. Mediante la combinaci�n de prote�nas, se puede suplir el d�ficit de amino�cidos y potenciar su s�ntesis en el organismo (Cervera et al., 2004). De acuerdo con el Comit� de Nutrici�n y Alimentos del Instituto de Medicina de Estados Unidos (FNB/IOM), el perfil de amino�cidos que debe cumplir una prote�na de calidad considerando el requerimiento de amino�cidos y prote�nas en ni�os ≥ 1 a�o y dem�s grupos de edades, es la siguiente: 1,8 % histidina; 2,5 % isoleucina; 5,5 % leucina; 5,1 % lisina; 2,5 % metionina; 4,7 % fenilalanina; 2,7 % treonina; 0,7 % tript�fano y 3,2 % valina (Institute of Medicine of the National Academies, 2005).

La presente investigaci�n se enfoca en la formulaci�n de una premezcla mediante la combinaci�n de dos alimentos con amino�cidos limitantes diferentes. Los cereales como la avena (Avena sativa) son deficientes en lisina con un valor de 41 � 45 mg/ g prote�na (4,1 - 4,5 %), pero completos en metionina con un valor de 15 � 20 mg/ g prote�na (1,5 - 2,0 %) (Pettersson et al., 1996). En contraste, las leguminosas como las arvejas (Pisum sativum) son deficientes en metionina con un valor de 10,3 mg/ g prote�na (1,03 %), pero completos en lisina con un valor de 68,4 mg/ g prote�na (6,84 %) (Leterme et al., 1990), de manera que pueden complementarse proteicamente (Cervera et al., 2004).

La premezcla puede consumirse de varias maneras debido a su presentaci�n como polvo. La forma de consumo depender� de la necesidad y del gusto de cada persona, sin embargo, por su composici�n al contener un cereal y un espesante (goma xantana) puede emplearse como un agregado en preparaciones como sopas, panes, coladas, batidos y galletas. En definitiva, esta premezcla se aprovecha de mejor manera al utilizarse en preparaciones que requieran de una consistencia espesa.

 

Materiales y m�todos

El dise�o de investigaci�n se realiz� mediante la propuesta de formulaciones de tres mezclas alimenticias, la cual, mediante an�lisis estad�stico se seleccion� la mejor combinaci�n en base a la cantidad de prote�nas. La formulaci�n seleccionada fue utilizada para realizar la caracterizaci�n de amino�cidos y los an�lisis microbiol�gicos.

 

Descripci�n de los componentes de las formulaciones

Polvo de arvejas (Pisum sativum): Aporta amino�cidos esenciales. Contiene altos niveles de lisina y es deficiente en tript�fano y en amino�cidos azufrados como metionina y ciste�na.

Harina de avena (Avena sativa): Aporta amino�cidos esenciales. Contiene altos niveles de tript�fano y amino�cidos azufrados como metionina y ciste�na.

Goma xantana: Es un polisac�rido (E � 415) procedente de la fermentaci�n del ma�z que act�a como un espesante. Confiere alta viscosidad al agregarse en preparaciones l�quidas como sopas, coladas, jugos, etc. En preparaciones como salsas, l�cteos como helados, productos de panader�a y pasteler�a, se lo puede usar como estabilizante o emulsionante

Preservantes (NS-1017S): Es un sistema de preservantes efectivo contra bacterias, mohos y levaduras, en un rango de pH de 5,0 a 6,5.� Los componentes qu�micos que componen el sistema son:

Propionato de sodio: Es una sal soluble y tiene una efectividad ideal a un pH de 5.0 en la mayor�a de las aplicaciones contra mohos y algunas bacterias que producen babosidad. Es inefectivo contra levaduras (CFR 184-1784).

Sorbato de potasio: Es efectivo hasta un pH de 6.5 contra levaduras y mohos. Es inefectivo contra bacterias (CFR 182.3640).

Acetato de calcio: Es efectivo hasta un pH de 4,5 contra levaduras y bacterias. Es inefectivo contra mohos (CFR 184.1185).

Cada uno de estos componentes tiene un rango �ptimo de pH as� como el tipo de microorganismos contra los cuales son efectivos. La combinaci�n de ellos hace un sistema m�s efectivo. Ello favorece una mayor estabilidad del alimento e incrementar su vida �til del producto

El desarrollo de la premezcla tipo suplemento se realiz� mediante la formulaci�n de tres tratamientos presentado en la Tabla 1.

 

Figura 1: Tratamientos del dise�o experimental

Porcentajes de los componentes de cada tratamiento.

^*Propionato de sodio, Sorbato de potasio, Acetato de calcio

 

El dise�o experimental estuvo basado en un dise�o completamente aleatorizado (DCA) el cu�l usa como procedimiento estad�stico el an�lisis de varianza (ANOVA). El dise�o estuvo compuesto de un factor (formulaci�n de la premezcla), tres tratamientos (niveles) y cinco repeticiones por tratamiento. En total se analizaron 15 datos y se realiz� el test de normalidad Shapiro - Wilk para determinar si los datos segu�an una distribuci�n normal y con ello aplicar el dise�o completamente aleatorizado (DCA). Si los datos no segu�an una distribuci�n normal, estos deb�an ser analizados mediante el m�todo no param�trico Kruskal � Wallis.

El an�lisis estad�stico determin� si exist�an diferencias significativas entre las tres formulaciones con respecto al contenido de prote�nas. En caso de que hubieran existido diferencias significativas entre los tratamientos, se habr�a realizado un an�lisis de medias de Tukey al 5 % de probabilidad.

Para la obtenci�n del polvo de arveja se emplearon granos de arveja (Pisum sativum), sorbato de potasio, bolsas de polipropileno de alta densidad. �Para la Obtenci�n de la premezcla se emple� polvo de arveja, harina de avena, goma xantana y preservantes: propionato de sodio, sorbato de potasio, acetato de calcio, bolsas de polipropileno de alta densidad. Dentro de los equipos se emplearon tamices, molinos, marmitas, Deshidratador (Model No: ST � 04 (T)), balanza.

La obtenci�n del polvo de arveja (Pisum sativum) se realiz� de acuerdo con el diagrama de flujo descrito en la Figura 1.

 

Figura 2: Etapas del proceso de obtenci�n del polvo de arveja (Pisum sativum)

 

Descripci�n de las etapas del proceso de obtenci�n del polvo de arveja

�         Recepci�n de materia prima: Se recept� la leguminosa en recipientes pl�sticos para su posterior selecci�n, pesados y limpieza.

�         Lavado: La limpieza de los granos se realiz� por inmersi�n en una soluci�n de sorbato de potasio al 1 %. La finalidad del lavado es limpiar el grano de cualquier impureza no visible que pudiera afectar la calidad final del polvo de arveja.

�         Selecci�n: En esta etapa se realiz� la selecci�n de los granos de arveja en base a las caracter�sticas f�sicas. Los granos que presentaron contaminaci�n por insectos, da�os f�sicos o material ajeno que pudieran comprometer la calidad del polvo de arveja, fueron desechados en un recipiente alterno.

�         Pesado: En una balanza se pes� la cantidad requerida para el posterior procesamiento de los granos de arveja.

�         Escaldado: En una marmita se sometieron los granos en agua a una temperatura de 100 �C durante 90 s. Esta etapa del proceso es fundamental porque inactiva la enzima lipoxigenasa, la cual es causante de aromas y sabores indeseables caracter�sticos de las leguminosas. Adicionalmente, tambi�n se logra disminuir la carga microbiol�gica de los granos.

�         Enfriamiento: Luego del escaldado, se sumergieron los granos inmediatamente en agua a temperatura de 20 �C durante 5 min., con la finalidad de detener el calentamiento del grano y evitar alteraciones no deseadas.

�         Secado: En esta etapa se disminuy� la aw de los granos en un deshidratador de acero inoxidable grado alimenticio (Model No: ST- 04(T)) a 55�C durante 7 h. Posteriormente se dej� enfriar a temperatura ambiente. El secado de los granos es importante porque evitar� la formaci�n de grumos en la siguiente etapa.

�         Molienda: Los granos secos se colocaron en el molino para ser triturados y posteriormente separados seg�n su granulometr�a en la siguiente etapa.

�         Tamizado: Los granos triturados se tamizaron en mallas de diferentes n�meros para la obtenci�n del polvo de arveja con un tama�o de part�cula de hasta 800 um.

�         Empacado: En fundas de polipropileno de alta densidad se empac� y se almacen� el polvo de arveja hasta su posterior uso.

 

Determinaci�n del contenido de prote�nas

Los reactivos empleados para la determinaci�n de prote�nas fueron: H2SO4 95-97 %, sulfato de cobre sulfato de potasio, NaOH 30 %, NaOH 0,1N, H₂SO₄ 0,1N, agua destilada e indicador rojo de metilo. Dentro de los materiales se puede mencionar:� Tubo Kjeldahl, perlas de vidrio, papel filtro, probeta, matraces erlenmeyer, bureta Matraz Aforado 1000ml, vasos precipitados, recipientes pl�sticos de 1 L, esp�tulas, aparato Kjeldahl, destilador de prote�nas, Sorbona.

El an�lisis de prote�nas se realiz� mediante el m�todo Kjeldahl determinando el contenido de nitr�geno org�nico total. El m�todo se divide en tres etapas: digesti�n, destilaci�n y valoraci�n.

Digesti�n: Se produce la descomposici�n del nitr�geno contenida en la muestra usando una soluci�n de �cido sulf�rico concentrado. El resultado es sulfato de amonio.

Destilaci�n: Se realiza la destilaci�n por arrastre de vapor de agua y se libera amoniaco, el cual se retiene con �cido sulf�rico.

Titulaci�n: Mediante titulaci�n se determina la cantidad de amonio presente en la muestra destilada (ESPOL, 2016).

Procedimiento:

1.      Pesar aprox. 1 g de muestra en papel filtro. Realizar la muestra por duplicado.

2.      Pesar 0,8 g sulfato de cobre y 7 g de sulfato de potasio y agregar en los tubos Kjeldahl.

3.      Agregar 6 - 10 perlas de vidrio en cada tubo.

4.      Agregar las muestras envueltas en papel filtro en los tubos Kjeldahl.

5.      Llevar los tubos a la campana de extracci�n y medir 25 ml de H₂SO₄ concentrado. Realizar un blanco (agregar todos los reactivos menos la muestra).�

6.      Se coloc� los tubos en la parrilla de digesti�n.

7.      Encender el regulador y el equipo y programar la temperatura de trabajo (Programa 4)

Paso 1: 150 �C / 15 min.

Paso 2: 150 �C / 15 min.

Paso 3: 300 �C / 30 min.

Paso 4: 400 �C / 90 min.

8.      Una vez terminado el programa, se alza el soporte de los tubos para evitar que siga el calentamiento y esperamos que se enfr�en.

9.      En un matraz Erlenmeyer se colocan 50 ml de �cido sulf�rico estandarizado al 0,1 N y se agrega 4 gotas de rojo de metilo.

10.  �Los tubos son colocados uno a uno en el equipo de destilaci�n junto a cada matraz para recolectar el destilado.

11.  �Se titula con NaOH 0,1 N; la titulaci�n termina cuando la soluci�n cambia a amarillo.

12.  �Anotar el volumen consumido por la bureta.

C�lculos:

El contenido de prote�nas en la muestra, en base seca, se calcul� mediante la ecuaci�n 1.

Ecuaci�n 1:

D�nde:

P= contenido de prote�nas en porcentaje de masa.

= volumen de la soluci�n 0,1 N , empleado para recoger el destilado de la muestra, en .

= normalidad de la soluci�n de �cido sulf�rico.

= volumen de la soluci�n 0,1 N de NaOH, empleado en la titulaci�n, en .

= normalidad de la soluci�n de NaOH.

= volumen de la soluci�n 0,1 N , empleado para recoger el destilado del ensayo en blanco, en .

= volumen de la soluci�n 0,1 N NaOH, empleado en la titulaci�n del ensayo en blanco, en .

m= masa de la muestra en g.

H= porcentaje de humedad en la muestra

F= factor para convertir el nitr�geno a prote�nas. (F=6.25) (ESPOL, 2016)

 

Caracterizaci�n de amino�cidos por m�todo HPLC

Para la caracterizaci�n de los amino�cidos se emple� Soluci�n de o-ftalaldeh�do (OPA), Metanol, Tamp�n borato, �cido mercaptopropi�nico, Kit de L-amino�cidos de SIGMA Chemicals Corp. Equipo de HPLC Shimadzu.

La determinaci�n del perfil de amino�cidos se realiz� mediante la combinaci�n de la soluci�n de o-ftalaldeh�do (OPA) con el �cido mercaptopropi�nico produciendo un derivado isoind�lico fluorescente que absorbe a 338 nm. La obtenci�n del derivado isoind�lico fluorescente se utiliz� para la detecci�n de los amino�cidos (Castillo et al., 2011).

Procedimiento:

1.      Preparar soluci�n de o-ftalaldeh�do (OPA) mezclando 50 mg de OPA, 4 ml de metanol, 500 μl de tamp�n borato y 50 μl de �cido mercaptopropi�nico.

2.      M�todo de derivatizaci�n de la muestra: En base al procedimiento reportado por Godel (1987), utilizar la derivatizaci�n con OPA para los amino�cidos primarios con una modificaci�n al reemplazar el mercaptoetanol por el �cido-3-mercaptopropi�nico.

3.      Realizar una mezcla autom�tica en el inyector durante 3 min de 30 μl de muestra con 180 μl de tamp�n borato a pH 10,4 y 30 μl de OPA.

4.      Condiciones cromatogr�ficas: Uso del equipo de HPLC Shimadzu con bombas LC-10 AD VP117 y autoinyector SIL-10 AD VP con un sistema controlador SCL10 AD VP y un detector UV SPD-10A. Uso de columna: Lichrospher 100 RP18, 5 μm (Merck) con detecci�n por UV a 338 nm a temperatura entre 30 y 35 �C a un flujo de 1,2 ml min, con un volumen de inyecci�n de 10 μl, utilizando un programa de gradiente binario. La fase m�vil es un gradiente en el tiempo de los solventes A (20 mM de buffer acetato s�dico con 0,018 % (v/v) de trietilamina y 0,03 % de tetrahidrofurano) y B (20 % de 100 mM de buffer acetato s�dico, 40 % de acetonitrilo y 40 % de metanol).

5.      Calibraci�n externa: Para la cuantificaci�n se realiz� una calibraci�n externa con mezcla de L-amino�cidos: �cido asp�rtico (Asp), �cido glut�mico (Glu), asparagina (Asn), serina (Ser), glutamina (Gln), histidina (His), glicina (Gly), threonina (Thr), alanina (Ala), arginina (Arg), tirosina (Tyr), valina (Val), metionina (Met), tript�fano (Tryp), fenilalanina (Phe), leucina (Leu) y lisina (Lys), a una concentraci�n de 0,25 μmol/ml en 0,1 N de HCl (Castillo et al., 2011).

 

An�lisis microbiol�gicos

Los insumos empleados fueron: filtro de membrana microporosa, placa est�ril con medio Sabouraud dextrosa agar, Tamp�n fosfato de pH 7,2, placa est�ril de agar biliar rojo violeta con glucosa y lactosa, Placa est�ril con medio de digesti�n de soja � case�na � agar, Caldo de enriquecimiento Mossel -Enterobacteriaceae. Pinzas est�riles, bomba vac�a, pipetas, tubos de ensayo, equipo de filtraci�n.

 

Recuento microbiano aerobio total - M�todo de filtraci�n por membrana

Este m�todo se fundamenta en determinar el n�mero y tipo de microorganismo retenido en la superficie de un filtro de membrana microporosa con poros de 0,45 μm de di�metro para su identificaci�n y recuento de colonias de los microorganismos retenidos. A trav�s de la membrana se filtr� un volumen conocido de muestra, incubada en un medio de cultivo durante un tiempo y a una temperatura adecuada (De Castro y De Curtis, 2002).

Procedimiento:

1.      Disolver 10 g de muestra en tamp�n fosfato de pH 7,2, medio l�quido de digesti�n de soja - case�na para hacer 100 ml.

2.      Pipetear 1 ml de la diluci�n final en 5 a 10 ml de tamp�n fosfato de pH 7,2, medio l�quido de digesti�n de soja � case�na.

3.      Lavar cada membrana con uno de los diluyentes anteriores y transferir cada membrana a una caja petri que contenga medio digerido de soja � case�na - agar previamente solidificado a temperatura ambiente.

4.      Incubar las placas a una temperatura de 30 a 35 �C durante 48 a 72 h.

5.      Luego de la incubaci�n, examinar las placas en busca de crecimiento.

6.      Contar el n�mero de colonias y expresar el promedio de las dos placas en t�rmino de n�mero de microorganismos por g de muestra.

En caso de no existir colonias microbianas en las placas que representan la diluci�n inicial 1:10 de la muestra, se expresar� los resultados como menos de 10 microorganismos por g de muestra (Microbiology and Sterility Assurance, 2021).

 

Recuento total de mohos y levaduras - M�todo de filtraci�n por membrana

Procedimiento:

Proceder con el m�todo de filtraci�n por membrana detallado en el procedimiento del recuento microbiano aer�bico total con excepci�n del medio. Se us� Sabouraud dextrosa agar en lugar de medio de digesti�n de soja � case�na � agar e incub� las placas durante 5 a 7 d�as a 20 �C � 25 �C.

 

Recuento de enterobacterias - M�todo de m�ltiples tubos

Fundamento

Mediante varias diluciones sucesivas de la muestra, se busc� obtener in�culos de al menos una c�lula que presente crecimiento en el medio de cultivo. Este m�todo consta de dos fases: fase presuntiva y fase confirmativa.

En la fase presuntiva se da la fermentaci�n de la lactosa y en la fase confirmativa la fermentaci�n de lactosa y producci�n de gas. La cantidad de tubos positivos y negativos permite obtener una estimaci�n de la densidad de bacterias obtenidas a trav�s de la aplicaci�n de c�lculos de probabilidad.

Procedimiento:

1.      Disolver 10 g de muestra en un volumen suficiente de tamp�n fosfato de pH 7,2 o medio l�quido de digesti�n de soja - case�na y diluir con medio l�quido de digesti�n de soja - case�na hasta 100 ml.

2.      Preincubar durante 2 a 5 horas a 20 �C � 25 �C en diluyente de caldo digerido de soja y case�na.

3.      Inocular cantidades adecuadas en caldo de enriquecimiento Mossel -Enterobacteriaceae para contener 0,1, 0,01, 0,001 g de producto.

4.      Incubar a 30 �C � 35 �C durante 24 a 48 horas.

5.      Subcultivar en una placa de agar biliar rojo violeta con glucosa y lactosa e incubar a 30 �C � 35 �C durante 18 a 24 horas.

El crecimiento de colonias bien desarrolladas, generalmente rojas o rojizas de bacterias Gramnegativas revelar� la presencia de enterobacterias.

 

An�lisis estad�stico

En base al supuesto de normalidad mediante la prueba Shapiro - Wilk, los datos siguieron una distribuci�n normal; por lo que, el an�lisis estad�stico se lo realiz� utilizando el an�lisis de varianza (ANOVA) (Tabla 2), caso contrario, se hubiera analizado mediante la Prueba no param�trica Kruskal - Wallis. El an�lisis determin� si exist�an o no diferencias significativas entre las formulaciones, con ello se determinaba la formulaci�n que aportaba mayor contenido proteico. Al no existir diferencias significativas, se utiliz� como factor de selecci�n la media m�s alta de las formulaciones para determinar aquella con mayor contenido proteico y posteriormente evaluar el perfil de amino�cidos y realizar los an�lisis microbiol�gicos.

 

Figura 3: Tabla de an�lisis de varianza para modelo de un solo factor y efectos fijos

 

An�lisis de varianza para modelo de un solo factor y efectos fijos

Montgomery, 2004

a: n�mero de tratamientos

N: n�mero total de observaciones

n: n�mero de observaciones por tratamiento

 

Prueba Kruskal � Wallis

El uso de la prueba Kruskal � Wallis requiere calcular el estad�stico de prueba descrito por la ecuaci�n 2 y la varianza de rangos descrita por la ecuaci�n 4 para concluir sobre la distribuci�n de los datos en caso de no existir normalidad.

Ecuaci�n 2: Estad�stico de prueba

Ecuaci�n 4: Varianza de los rangos

�(Montgomery, 2004)

 

Resultados y discusi�n

Desarrollo de las� formulaciones de las premezcla a base de avena y polvo de arvejas

Para el desarrollo de las formulaciones de la premezcla fueron realizadas con harina de avena, polvo de arveja obtenido a partir de granos de arvejas deshidratados, el espesante goma xantana para la mejora tecnol�gica del producto y el sistema de preservantes NS-1017S.

Para la experimentaci�n de las formulaciones con los ingredientes propuestos se siguieron las etapas a continuaci�n: el proceso de la obtenci�n de la premezcla inici� con el lavado de los granos mediante inmersi�n en una soluci�n de sorbato de potasio al 1 %. Los granos fueron seleccionados, aquellos que presentaban contaminaci�n por insectos, da�os f�sicos o conten�an alg�n material ajeno que pudieran comprometer la calidad del polvo, se desechaban en un recipiente alterno y pesado.

Posteriormente, los granos se escaldaron en un recipiente met�lico a una temperatura de 100 �C durante 90 s para lograr la inactivaci�n de la enzima lipoxigenasa y reducir carga microbiol�gica. Luego del escaldado, los granos fueron sumergidos inmediatamente en agua a temperatura de 20 �C durante 5 min, con la finalidad de detener el calentamiento del grano y evitar alteraciones no deseadas.

Los granos secos y fr�os fueron deshidratados en un deshidratador de acero inoxidable grado alimenticio (Model No: ST- 04(T)) a 55�C durante 7 h y se dej� enfriar a temperatura ambiente. Finalmente, los granos secos fueron molidos, tamizados, mezclados con la avena y los aditivos, y empacados en fundas de polipropileno de alta densidad para evitar la contaminaci�n con el ambiente.

Una vez obtenido el polvo de arvejas, se procedi� a realizar la mezcla con el resto de los ingredientes para la obtenci�n de las formulaciones.

El porcentaje de la harina de avena y el polvo de arvejas en la f�rmula fue definido mediante el estudio de art�culos cient�ficos sobre la mejor combinaci�n entre cereales y leguminosas; y los aditivos fueron a�adidos considerando la dosis de la ficha t�cnica respectiva o mediante la revisi�n de documentos oficiales como el Codex Alimentarius o el reglamento (UE) de la Comisi�n Europea sobre el uso de aditivos alimentarios, esta informaci�n fue empleada como bases t�cnicas para el desarrollo del producto.

La selecci�n de ingredientes y aditivos es de gran importancia para la obtenci�n del suplemento, ya que esto determina la calidad del producto final. Para la elaboraci�n del suplemento nutricional se hizo uso de los siguientes ingredientes: - Polvo de arvejas (Pisum sativum), aporta amino�cidos esenciales. Contiene altos niveles de lisina y es deficiente en tript�fano y en amino�cidos azufrados como metionina y ciste�na. - Harina de avena (Avena sativa), aporta amino�cidos esenciales. Contiene altos niveles de tript�fano y amino�cidos azufrados como metionina y ciste�na.

En cuanto a los aditivos alimentarios empleados fueron: - Goma xantana, es un polisac�rido (E � 415) procedente de la fermentaci�n del ma�z que act�a como un espesante. Confiere alta viscosidad al agregarse en preparaciones l�quidas como sopas, coladas, jugos, etc. En preparaciones como salsas, l�cteos como helados, productos de panader�a y pasteler�a, se lo puede usar como estabilizante o emulsionante.� -Preservantes (NS-1017S), es un sistema de preservantes efectivo contra bacterias, mohos y levaduras, en un rango de pH de 5,0 a 6,5.� Los componentes qu�micos que componen el sistema son: propionato de sodio, sorbato de potasio, acetato de calcio. Cada uno de estos componentes tiene un rango �ptimo de pH as� como el tipo de microorganismos contra los cuales son efectivos. Ello propicia una mayor estabilidad del alimento e incrementar su vida �til del producto.

Se desarrollaron tres formulaciones. La primera formulaci�n conten�a 60% avena 40% arveja, la segunda formulaci�n 50% avena 50% arveja y la tercera formulaci�n 40% avena 60% arveja. El porcentaje de los aditivos se mantuvo constante ya que estos no ten�an influencia en el contenido final de prote�nas de la premezcla y por ende en la concentraci�n final de los amino�cidos, obteniendo as� los prototipos de estudio.

Para la selecci�n de la mejor formulaci�n, que se ajuste al concepto del producto planteado en la presente investigaci�n, se analiz� el contenido de prote�nas con ayuda de un dise�o completamente aleatorizado (DCA), el cual ten�a como objetivo analizar el efecto de las combinaciones avena: arveja en el contenido total de prote�nas. La aplicaci�n del dise�o experimental se realiz� considerando un factor, tres tratamientos y 5 repeticiones. El factor era la proporci�n avena: arveja, los tratamientos eran las formulaciones y las repeticiones el n�mero de an�lisis de prote�nas que se iba a realizar por tratamiento.

Finalmente, se analiz� el perfil de amino�cidos a la formulaci�n seleccionada del dise�o experimental para su posterior comparaci�n con el perfil de amino�cidos propuesto por la FNB/IOM y la FAO a diferentes grupos etarios. De esta manera, se determin� el segmento de poblaci�n que pod�a consumir la premezcla y se valida el planteamiento de la formulaci�n que se ajustaba al eje central de la investigaci�n.

 

Determinaci�n del contenido de prote�nas de las formulaciones mediante m�todo Kjeldhal

Las tres formulaciones planteadas fueron analizadas utilizando muestras de aproximadamente 200 g en condiciones clim�ticas de ensayo de 22,5 �C � 2,5 �C de temperatura y 55 % � 15 % de humedad relativa. La Tabla 3 indica los porcentajes de prote�na de las tres formulaciones con cinco repeticiones por formulaci�n.

 

Figura 4: Cantidad de prote�nas de las tres formulaciones

 

Porcentaje del contenido de prote�nas

El porcentaje de prote�na de las tres formulaciones se encuentra en un rango de 13 � 14 %. En el dise�o experimental, los valores de cada formulaci�n ayudar�n a determinar si variar el porcentaje de avena y arveja influye significativamente en el contenido de prote�nas entre las formulaciones.

 

Resultados del dise�o experimental

Prueba de normalidad: Shapiro � Wilk

La Tabla 4 muestra el resultado de la prueba de normalidad para las tres formulaciones. El valor de significancia es mayor a 0,05, por lo tanto, no se rechaza la hip�tesis nula. Es decir, las tres formulaciones siguen una distribuci�n normal. Las Figuras 2, 3 y 4 muestran el test de normalidad de las formulaciones.

 

Figura 5: Test de normalidad de las tres formulaciones

 

Valor α= 0,05

Formulaci�n 1

 

Figura 6: Test de normalidad para la formulaci�n 1

 

Formulaci�n 2

 

Figura 7: Test de normalidad para la formulaci�n 2

 

Formulaci�n 3

 

Figura 8: Test de normalidad para la formulaci�n 3

 

Dise�o completamente aleatorizado (DCA)

En la Tabla 5 se puede observar que el valor de significancia es mayor a 0,05, por lo tanto, se acepta la hip�tesis nula. No hay diferencias significativas entre las tres formulaciones, es decir, se puede escoger cualquiera de las tres formulaciones para realizar el an�lisis del perfil de amino�cidos y microbiol�gico seg�n los objetivos planteados.

 

Figura 8: An�lisis de las tres formulaciones

 

Valor de significancia de los tratamientos

Es decir que estad�sticamente con la cantidad de datos analizados (15 datos) no se pudo demostrar que hay diferencias significativas. Por lo tanto, se considera la media de las formulaciones como un indicador para la selecci�n del tratamiento con el mayor contenido de prote�nas y con ello realizar el an�lisis del perfil de amino�cidos.

��� En la Tabla 6 se muestra los valores de la media de cada formulaci�n.

 

Figura 9: Media de las tres formulaciones

 

Media del contenido de prote�na de las tres formulaciones

Para analizar el perfil de amino�cidos se seleccion� la formulaci�n 1 dado que la media es levemente m�s alta en comparaci�n a la media de la formulaci�n 2 y la formulaci�n 3 como se observa en la tabla.

Determinaci�n del perfil de amino�cidos de la formulaci�n seleccionada

El perfil de amino�cidos de la formulaci�n 1 fue analizado por el laboratorio anal�tico UBA acreditado. Los resultados fueron presentados en unidades de g amino�cido / 100 g muestra (g AA / 100 g) como se detalla en la Tabla 7.

 

Figura 10: Perfil de amino�cidos esenciales y no esenciales de la formulaci�n 1

 

 

Perfil de amino�cidos de la formulaci�n con mayor contenido de prote�nas

La Tabla 7 indica que la formulaci�n 1 contiene mayor cantidad de �cido glut�mico y tript�fano, y menor cantidad de metionina.

 

Comparaci�n del perfil de amino�cidos de la formulaci�n seleccionada con el perfil de amino�cidos dado por la FNB/IOM y FAO

La Tabla 8 detalla el perfil de amino�cidos esenciales de la formulaci�n 1, el perfil de amino�cidos descrito por el Comit� de Alimentaci�n y Nutrici�n del Instituto Americano de Medicina (FNB/IOM) para ni�os de 1 a 3 a�os y el perfil de amino�cidos descrito por la Organizaci�n de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentaci�n (FAO) para ni�os lactantes, mayores de 3 a�os, adolescentes y adultos.

 

Figura 11: Perfil de amino�cidos esenciales de la formulaci�n 1

Amino�cidos esenciales de la prote�na de la formulaci�n 1

Young y Pellett, 1990; Millward et al., 1990; FAO/WHO/UNU, 1985; FNB/IOM, 2002.

FAO, 2011

 

El perfil de amino�cidos de la formulaci�n 1 fue transformado de g AA/100 g muestra a mg AA/g prote�na mediante la conversi�n de unidades para la comparaci�n con los niveles de amino�cidos descritos por la FNB/IOM y la FAO. A continuaci�n, la ecuaci�n 3 detalla el procedimiento del c�lculo de mg AA/g prote�na a partir de g AA/100 g muestra considerando como ejemplo el amino�cido histidina.

Contenido de prote�nas de la formulaci�n 1: �

Amino�cido histidina:

Ecuaci�n 3:

 

La comparaci�n del perfil de amino�cidos de la formulaci�n seleccionada con el perfil de amino�cidos detallado por la FAO y la FNB/IOM, indican que esta premezcla cumple con los requisitos m�nimos de amino�cidos para ser consumido por ni�os mayores a 1 a�o, adolescentes y adultos; pero no es apto para ser consumido por lactantes (< 6 meses) ni para ni�os menores a 1 a�o (6 meses a 1 a�o).

 

An�lisis microbiol�gicos de la formulaci�n seleccionada seg�n la Norma T�cnica Ecuatoriana INEN 2983

La Tabla 9 compara los resultados de los an�lisis microbiol�gicos realizados a la formulaci�n 1 con los requisitos microbiol�gicos estipulados en la norma NTE INEN 2983 para complementos nutricionales Tipo II (Complementos nutricionales que contienen ingredientes bot�nicos � extractos/ otros ingredientes nutricionales).

 

Figura 12: An�lisis microbiol�gicos de la formulaci�n 1

Comparaci�n de los an�lisis microbiol�gicos de la formulaci�n seleccionada con los requisitos estipulados en la norma NTE INEN 2983.

 

La formulaci�n 1 cumple con todos los requisitos microbiol�gicos para complementos nutricionales Tipo II estipulados en la norma NTE INEN 2983.

 

Discusi�n

El cumplimiento de las etapas para el desarrollo de la formulaci�n del suplemento result� crucial para obtener un producto final de buena calidad y con las caracter�sticas deseadas. Tal como lo menciona C�mpora (2016) la generaci�n de conocimiento y de tecnolog�as orientadas al desarrollo de los productos, a su diferenciaci�n en el mercado y a su valorizaci�n, resultan elementos fundamentales en la generaci�n de propuestas de alimentos que respondan a necesidades concretas de la poblaci�n. No solo con el objetivo de responder a las demandas de la cadena de valor y de la calidad impl�cita esperada por los consumidores sino tambi�n para contribuir en propuestas con mayor competitividad en los sectores agroindustriales.

El elemento de mayor repercusi�n en el desarrollo de productos se fundamenta en la implementaci�n de t�cnicas de calidad, que junto a la innovaci�n permiten alcanzar los objetivos planteados ya sea de investigaci�n o de recursos econ�micos deseados con un nuevo producto a nivel empresarial. Seg�n lo indica Zapata-G�mez (2013) ese alcance de la calidad en el dise�o de una formulaci�n implica la integraci�n de conocimientos que contribuyen a establecer las bases de una estructura que puede ser llevada a un campo productivo otorgando estrategias para mantenerse en el mercado. Estos elementos en la formulaci�n de productos, han sido tomados en cuanta para el desarrollo del suplemente detallado en la presente investigaci�n.

Los resultados del contenido de prote�nas de la premezcla a base de avena y polvo de arveja (cereal y leguminosa) concuerdan con la investigaci�n realizada por el autor Santill�n (2018), el cu�l desarroll� mezclas alimenticias a base de cuatro cereales y cuatro leguminosas con el fin de obtener la combinaci�n de mejor calidad aminoac�dica (lisina, metionina, ciste�na, treonina, tript�fano, histidina). Los cereales utilizados fueron el arroz (Oryza sativa), el trigo (Triticum aestivum), la avena (Avena sativa) y el ma�z (Zea mays); y las leguminosas utilizadas fueron el chocho (Lupinus mutabilis), la arveja (Pisum sativum), la lenteja (Lens culinaris), y el frijol (Phaseolus vulgaris). De 144 mezclas alimenticias 99 ten�an la calidad biol�gica deseada. Adicionalmente, obtuvo como resultado que las mezclas con mayor proporci�n de cereal (mezclas cereales:leguminosas 2:1) presentaban valores m�s altos de amino�cidos. Por lo tanto, se comprueba que la mezcla de un cereal m�s una leguminosa forma prote�nas de alto valor biol�gico y se confirma que los resultados obtenidos del dise�o experimental fueron los correctos, dado que para realizar el an�lisis del perfil de amino�cidos se seleccion� la formulaci�n con mayor valor proteico seg�n las medias obtenidas y cuya proporci�n de cereal result� tambi�n ser mayor seg�n las formulaciones planteadas. Por otra parte, los autores Fern�ndez y Guivar (2016) determinaron el contenido proteico y el aporte energ�tico de una formulaci�n a base de dos leguminosas y un cereal (arveja, tarwi y kiwicha), obteniendo como resultado que la formulaci�n con 25 % de arveja, 25 % de tarwi y 50 % de kiwicha (amaranto) tiene un mayor contenido proteico donde el 65% corresponde a la kiwicha. Una vez m�s, se reafirma que el cereal brinda mayor contenido de prote�nas y por tanto mayor proporci�n de amino�cidos en una mezcla que tambi�n contenga leguminosas.

El valor biol�gico de una prote�na (para satisfacer las necesidades de amino�cidos) es determinado por su disponibilidad en el alimento y por la correcci�n de digestibilidad de cada amino�cido, es decir, la proporci�n absorbida del amino�cido consumido. El alcance de esta investigaci�n se limita al an�lisis de la disponibilidad de amino�cidos en el alimento, considerando como fuente principal de verificaci�n el perfil de amino�cidos dado por el Comit� de Alimentaci�n y Nutrici�n del Instituto Americano de Medicina (FNB/IOM) y la Organizaci�n de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentaci�n (FAO). Estos organismos internacionales detallan los valores m�nimos requeridos de cada amino�cido para diferentes grupos etarios.

El perfil de amino�cidos de la premezcla a base de harina de avena y polvo de arvejas cumpli� con todos los valores detallados en las tablas de la FNB/IOM y la FAO exceptuando a los indicados para lactantes. En este caso, los lactantes se consideran como un grupo especial, dado que los valores de los amino�cidos detallados en las tablas de la FNB/IOM y la FAO est�n basados en el contenido bruto de amino�cidos de la prote�na de la leche humana, ya que son la mejor estimaci�n de requerimientos para este grupo de edad.

La FNB/IOM y la FAO recomiendan realizar la estimaci�n de la cantidad de cada amino�cido que puede ser absorbida por el tracto digestivo (la digestibilidad de cada amino�cido) para obtener un mejor enfoque de la prote�na o de la combinaci�n de prote�nas de un alimento.

Finalmente, es importe mencionar que la mezcla propuesta cumple con los requisitos microbiol�gicos seg�n lo indicado en la normativa de referencia Norma T�cnica Sanitaria 071-MINSA/DIGESA V-01 (2008).

 

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� 2022 por los autores. Este art�culo es de acceso abierto y distribuido seg�n los t�rminos y condiciones de la licencia Creative Commons Atribuci�n-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional (CC BY-NC-SA 4.0)

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