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Identificaci�n de ant�genos espec�ficos de Dictyocaulus viviparus en diferentes extractos proteicos

 

Identification of specific antigens of Dictyocaulus viviparus in different protein extracts

 

Identifica��o de ant�genos espec�ficos de Dictyocaulus viviparus em diferentes extratos proteicos

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Correspondencia: asterio.barbaru@espoch.edu.ec

 

 

 

Ciencias T�cnicas y Aplicadas �

Art�culo de Investigaci�n

 

* Recibido: 23 de mayo de 2022 *Aceptado: 12 de junio de 2022 * Publicado: 31 de julio de 2022

 

         I.            Escuela Superior Polit�cnica de Chimborazo (ESPOCH), Sede Orellana, Ecuador.

       II.            Escuela Superior Polit�cnica de Chimborazo (ESPOCH), Riobamba, Ecuador.

     III.            Dpto de Producci�n Animal Universidad de Las Tunas, Cuba.

 

Resumen

Con la finalidad de estudiar la composici�n del mosaico antig�nico de D viviparus fueron preparados tres extractos proteicos: som�tico total, som�tico parcialmente purificado y productos de excreci�n-secreci�n, los cuales fueron analizados por SDS-PAGE, observ�ndose un total de 13 polip�ptidos, que resultaron ser antig�nicos del par�sito cuando se realiz� el Western BLOT. Tres bandas �nicas especificas a D viviparus fueron identificadas y su peso molecular fue de 17, 24 y 29 Kd respectivamente, las mismas originaron alta frecuencia de reacci�n frente al suero hom�logo, mientras no originaron frecuencia de reacci�n alguna cuando fueron enfrentadas con los sueros heter�logos: Fasciola hep�tica, Trichostrongylus(sp), y Cooperia(sp). Estos ant�genos forman parte del extracto som�tico purificado y el estudio de sus caracter�sticas moleculares puede establecer un rol importante de su desempe�o en la biolog�a del par�sito.

Palabras claves: D. viviparus; ant�genos; Western Blot.

 

Abstract

In order to study the composition of the antigenic mosaic of D viviparus, three protein extracts were prepared: total somatic, partially purified somatic and excretion-secretion products, which were analyzed by SDS-PAGE, observing a total of 13 polypeptides, which resulted be antigenic to the parasite when Western BLOT was performed. Three unique bands specific to D viviparus were identified and their molecular weight was 17, 24 and 29 Kd respectively, they caused a high frequency of reaction against the homologous serum, while they did not cause any frequency of reaction when they were faced with heterologous sera: Fasciola hepatica, Trichostrongylus(sp), and Cooperia(sp). These antigens are part of the purified somatic extract and the study of their molecular characteristics can establish an important role of their performance in the biology of the parasite.

Keywords: D. viviparus; antigens; Western blot.

 

Resumo

Para estudar a composi��o do mosaico antig�nico de D viviparus, foram preparados tr�s extratos prot�icos: som�tico total, som�tico parcialmente purificado e produtos de excre��o-secre��o, os quais foram analisados ​​por SDS-PAGE, observando-se um total de 13 polipept�deos, que resultaram ser antig�nico ao parasita quando o Western BLOT foi realizado. Foram identificadas tr�s bandas �nicas espec�ficas para D viviparus e seus pesos moleculares de 17, 24 e 29 Kd respectivamente, causaram uma alta frequ�ncia de rea��o contra o soro hom�logo, enquanto n�o causaram nenhuma frequ�ncia de rea��o quando confrontados com soros heter�logos : Fasciola hepatica, Trichostrongylus(sp) e Cooperia(sp). Esses ant�genos fazem parte do extrato som�tico purificado e o estudo de suas caracter�sticas moleculares pode estabelecer um importante papel de sua atua��o na biologia do parasita.

Palavras-chave: D. viviparus; ant�genos; Mancha ocidental.

 

Introducci�n

El gusano parasito Dictyocaulus viviparus causa importantes problemas econ�micos y de bienestar para la industria ganadera (Springer y col., 2021). El conocimiento sobre las estructuras y funciones de� las� prote�nas del par�sito� puede contribuir al esclarecimiento de aspectos de su� biolog�a (Springer y col.,2022) , lo que puede permitir� la generaci�n de nuevas estrategias de prevenci�n y/o tratamiento para esta parasitosis , as� como el mejoramiento de los m�todos diagn�sticos� y ensayos de protecci�n� (Yuan y col.,� 2021), sobre todo si se tiene en cuenta que en la actualidad , las terapias disponibles para el tratamiento de son� poco eficientes, por� la aparici�n de resistencia de los par�sitos a los agentes� empleados para combatirlos (Kelleher y col., 2020)

Existen en D. viviparus varios componentes antig�nicos: de car�cter som�tico, tegumentario y de excreci�n-secreci�n (Umair y col.,2017). De los ant�genos mencionados anteriormente los som�ticos y los de excreci�n-secreci�n han sido los m�s empleados en el diagn�stico de esta parasitosis (Barbaru y col., 2017).� Los extractos utilizados pueden ser utilizados adem�s para otros fines, siempre y cuando se le realicen estudios que evidencien la naturaleza molecular y funcional de los mismos (Kim y col., 2019)

El hecho de que los ant�genos som�ticos totales se encuentren presentes en otros par�sitos, tales como: Fasciola hep�tica Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophora, Ascaris suum, y otros, origina reacciones cruzadas, puesto que son capaces de reaccionar con el suero de terneros infestados con otras parasitosis (De Leeuw y Cornelissen, 1991; Schnieder, 1992; Mccarthy y col., 2019).� Con los ant�genos de excreci�n-secreci�n, tambi�n se presenta, aunque en menor cuant�a, este fen�meno (Britton y Murray, 2002).

El presente trabajo tiene como objetivo identificar los componentes antig�nicos de D. viviparus en diferentes extractos proteicos con el empleo de la t�cnica de Western Blot.

 

Materiales y m�todos

 

Preparaci�n de extractos proteicos de Dictyocaulus viviparus

Se prepararon tres formulaciones de extractos proteicos a partir de par�sitos adultos de D. viviparus que fueron lavados con SSTF (Soluci�n salina tamponada con fosfato).

 

Productos de excreci�n � secreci�n (AES)

Se utiliz� la t�cnica de mantenimiento in vitro seg�n el procedimiento descrito por Britton y Murray, 2002; con modificaciones (mantenimiento in vitro individual a raz�n de cuatro par�sitos por cada dos mililitros de medio de cultivo).

Se emplearon 20 terneros de tres a seis meses de edad, raza Holstein y sus cruces, que resultaron positivos a D. viviparus por larvoscop�a (Baerman) fueron sacrificados, y se extrajeron par�sitos adultos de sus pulmones con pinzas, los cuales se lavaron repetidas veces con SSTF est�ril que conten�a 100 mg/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina y 10 mg/mL de gentamicina. El mantenimiento in vitro fue estandarizado previamente hasta lograr la supervivencia del 100 % de los par�sitos. El procedimiento general es como se describe: lavar los par�sitos repetidamente SSTF 0,05 moles/L, pH 7,2; e incubarlos en medio RPMI-1640 con L-glutamina pH 7,2 (RPMI- 1640 + 15 mL de HEPES 25 mMoL/ L + 7mL de bicarbonato de sodio 7,5 % + 100 mg/mL penicilina + 100 mg/mL de estreptomicina) a raz�n de 4 par�sitos por cada 2 mL de medio en frascos (4,5 x 1,5 cm) a 37 ⁰C.

La viabilidad y motilidad de los par�sitos fue observada en un microscopio invertido Olympus HK. Despu�s de 24 horas de mantenimiento, los medios que conten�an los extractos proteicos fueron colectados, y se les a�adi� inmediatamente una mezcla de inhibidores de proteasas compuestos por Iodoacetamida, Acido etilendiaminotetrac�tico y Fluoruro de fenilsulfonilmetano, a una concentraci�n final de 2 mMoles/L, 5 mMoles/L y 8 mMoles/L respectivamente. Los medios obtenidos fueron centrifugados a 3000 r.p.m. en una centr�fuga refrigerada MCW modelo K70D, a 4 �C durante 10 min. Los sobrenadantes obtenidos fueron colectados; concentrados por ultrafiltraci�n (PM > 10 kD, AMICON Corp.); y finalmente fueron desalinizados en una columna PD-10 (Sephadex G-25). Al extracto proteico obtenido se le determin� el contenido de prote�nas (Smith y col., 1885); y fueron conservados en congelaci�n (�20 �C) en al�cuotas de 1mL hasta su uso.

 

Productos som�ticos

Despu�s de finalizado el mantenimiento in vitro para la obtenci�n de los productos som�ticos totales los par�sitos fueron desintegrados, seg�n el procedimiento descrito por Pyziel� y col. (2018).

Se lavaron repetidas veces con SSTF est�ril y, posteriormente fueron triturados y homogenizados en fr�o empleando un homogenizador Medigen EL226 y se le a�adi� una mezcla de inhibidores de proteasas en la misma proporci�n en que se utiliz� en el mantenimiento in vitro, luego se colocaron en agitaci�n constante a 4 ⁰C durante 16 horas; al cabo de las cuales se procedi� a realizar una centrifugaci�n a 12 000 en una centr�fuga refrigerada MCW modelo K70D, a 4 ⁰C. El sobrenadante fue filtrado y colectado con el empleo de filtros milipore de 0.2 micr�metros.

 

Productos som�ticos totales

Una parte del preparado proteico fue concentrado por ultrafiltraci�n AMICON (PM > 10 kD, AMICON Corp.). La concentraci�n de prote�nas fue determinada y fueron posteriormente conservados en congelaci�n (�20 �C) en al�cuotas de 1 mL hasta su uso.

Productos som�ticos purificados por ultrafiltraci�n AMICON

La otra porci�n del extracto fue colocada en un vaso AMICON y ultrafiltrada (PM > 30 kD AMICON Corp.). El filtrado obtenido se colect� y concentr� por ultrafiltraci�n (PM > 10 kD, AMICON Corp.). La concentraci�n de prote�nas fue determinada (Smith y col., 1985) y fueron posteriormente conservados en congelaci�n (�20 �C) en al�cuotas de 1mL hasta su uso.

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Sueros para el desarrollo del Western blot

Suero hom�logo: Para obtener dicho suero se emple� un ternero que fue destetado a los 7 d�as de nacido, y se mantuvo en cr�a artificial hasta los 30 d�as, periodo en el que se le provoc� una infestaci�n experimental (May y col., 2018), administr�ndole por v�a oral una dosis de 50 larvas III de D. viviparus por Kg de peso. Pasada la sexta semana postinfestaci�n, se le realiz� una toma de muestra de heces, la cual fue procesada por el ensayo de Baerman. Una vez detectada la positividad a tres cruces por este ensayo, indicativo de que el animal pose�a una alta infestaci�n, el mismo fue sacrificado, y tanto las muestras de suero, como las de heces fueron colectadas y guardadas en congelaci�n (-20 ^oC) hasta su posterior uso.

Sueros heter�logos: Fueron seleccionadas dos muestras de animales, las cuales fueron analizadas por sedimentaci�n y flotaci�n, una cuyo resultado parasitol�gico fue positivo a Fasciola hep�tica, y Oesophagostomum radiatum., y la otra con resultado positivo a Trichostrongylus (sp), Cooperia (sp) y Haemonchus (sp).

 

SDS PAGE-Western Blot

La transferencia de las prote�nas separadas por la t�cnica de Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (Laemmli, 1970) a la membrana de nitrocelulosa se realiz� seg�n el procedimiento de Towbin y col. (1979).

Los extractos proteicos fueron diluidos en proporci�n 2:1 en el tamp�n de aplicaci�n compuesto por: 0,01 M TRIS-HCL, pH 6,8; 2,5 % Duodecil sulfato de sodio, 0,1 % de Bromofenol azul y 10 % de glicerol y posteriormente fueron desnaturalizados por calor durante 3 minutos a 100�C. M�s tarde fueron aplicados junto con un patr�n de mediano peso molecular constituido por: Lisozima (14 kD), Inhibidor de Tripsina (21 kD), Anhidrasa Carb�nica (31 kD; Ovoalb�mina (45 kD); Alb�mina Bovina (66 kD), y Fosforilasa b (97 kD, sobre el minigel (concentrador al 5 %, 5 mm de altura; separador al 12 % con un tama�o de 80 x 55 x 0,75 mm) y fueron sometidos a corriente constante (25 mA-75 mm de gel) durante aproximadamente 45 minutos en un equipo de Electroforesis Vertical (mini protean II, Bio RAD). Al finalizar la corrida las bandas de prote�nas de una parte del minigel fueron reveladas por tinci�n con azul Coomassie 0,1 % disuelto en soluci�n metanol-ac�tico-agua.

Para realizar el Western Blot la otra parte del gel fue sumergida durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA) y agitaci�n constante en el tamp�n de transferencia (25 mM de TRIS, 192 mM de Glicina, 20 % de metanol, pH 8,6); luego se realiz� la transferencia del patr�n electrofor�tico hacia una membrana de nitrocelulosa de 0,2 mm, para ello se emple� un equipo de transferencia semiseco (mini proteam Transfer Unit, BioRAD) a 15 volt., durante 2 horas. Al transcurrir este tiempo la nitrocelulosa fue bloqueada con gelatina al 2,5 % disuelta en una soluci�n de salina tamponada con fosfato (SSTF) que conten�a un 0,5 % de Tween-20 (SSTF-T), durante 1 hora a TA. Posteriormente fue cortada en tiras de 5 mm de ancho las cuales fueron sumergidas en el suero hom�logo y los heter�logos, diluidos 1/100 en SSTF-T e incubadas toda la noche a 4 ^oC.

Despu�s se realizaron 3 lavados con SSTF-T de 5 minutos cada uno, m�s tarde las tiras fueron incubadas durante 2 horas a 37 ^oC con la soluci�n de conjugado (anti-IgG de bovino peroxidasa de r�bano, SIGMA), diluida 1:1000 en SSTF-T. Luego de tres lavados con SSTF-T las tiras fueron incubadas con la soluci�n de sustrato (10 mg de 3,3�diaminobencidine tetrahidrocloride, SIGMA; 10 ml de H₂O₂ 30 % w/v; 10 mL de SSTF). Una vez visualizadas las bandas fueron sumergidas las tiras en agua destilada.

El peso molecular de cada una de las bandas observadas fue estimado a trav�s del c�lculo de su movilidad relativa, mediante una curva de calibraci�n previamente confeccionada a partir de un patr�n de prote�nas de mediano peso molecular que fue corrido en la electroforesis en iguales condiciones que los extractos proteicos y cuyos pesos moleculares fueron transformados en logaritmos y graficados contra sus correspondientes movilidades relativas mediante un tratamiento de correlaci�n lineal simple (r = 0, 98).

 

�Resultados y discusi�n

�La Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (Figura 1), mostr� que existe una gran variedad de componentes polipept�dicos en un amplio rango, que abarca desde los 17 hasta 114 kD, de los cuales tres est�n presentes en todos los extractos proteicos analizados. La composici�n proteica del extracto som�tico de par�sitos adultos es la m�s compleja con 13 polip�ptidos (17, 24, 29, 34, 37, 45, 52, 66, 69, 98, 103, 108 y 114 kD, respectivamente) observables, en la composici�n de los productos de excreci�n-secreci�n se observan cinco polip�ptidos, y es� m�s sencilla, la del extracto som�tico purificado donde� son observables solamente tres polip�ptidos, todos por debajo de los 30 kD.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 1: Electroforesis en geles de poliacrilamida de diferentes extractos proteicos. 1- Extracto proteico som�tico total. 2- Productos de excreci�n-secreci�n. 3- Extracto proteico som�tico purificado.

 

En el ensayo de Western Blot (figura 2) los polip�ptidos identificados por SDS-PAGE, resultaron ser ant�genos de D. viviparus, coexisten en todos los casos un total de tres ant�genos por debajo de los 30 kD. El peso molecular estimado para los ant�genos del extracto som�tico purificado es de 17, 24, y 29 kD respectivamente, y coincide con los resultados obtenidos por otros autores (daSilva y col., 2018); quienes, en un extracto som�tico total, identificaron conjuntamente con otras mol�culas estos polip�ptidos de bajo peso molecular.

�Estos componentes fueron identificados tambi�n por Holzhausen y col.,(2018), quienes detectaron en un ensayo similar,� reacci�n de estas bandas del extracto total frente al suero hom�logo, y reportaron� adem�s en los productos de excreci�n-secreci�n, reactividad para estas mismas bandas, y otras cuatro que reaccionaron con sueros heter�logos, resultado que coincide en alguna medida con los ant�genos de excreci�n- secreci�n que obtuvimos, aunque� en nuestro caso solo encontramos dos bandas, es por eso, que independientemente que los ant�genos de excreci�n-secreci�n se les atribuye una reactividad cruzada importante con F hepatica (Becker y col., 2017), en nuestro an�lisis, estos� componentes de reacci�n cruzada parecen encontrarse en proporciones m�nimas pues solo se observaron dos bandas que reaccionaron frente a los sueros heter�logos , lo cual puede deberse a que el mantenimiento in vitro que realizamos difiere notablemente del de otros autores (Britton y Murray., 2002) porque los productos metab�licos fueron colectados en un menor tiempo (24 horas) y adem�s, lo realizamos de forma individual, mientras que los restantes investigadores que han desarrollado este tipo de ensayo, prolongan el tiempo de mantenimiento a m�s de tres d�as en un recipiente con un gran n�mero de par�sitos, por lo que es probable que se introduzcan al medio sustancias propias del desprendimiento tegumentario, productos de degradaci�n u otros de naturaleza no metab�licas, los cuales pudieran ser los causantes de las reacciones inespec�ficas. (Figura 2)

 

Figura 2: Identificaci�n de ant�genos con el Western Blot. 1- Ant�genos som�ticos totales. 2-Ant�genos de excreci�n secreci�n. 3- Ant�genos som�ticos purificados.

 

Al evaluar la reactividad cruzada con� el empleo del� Western Blot (Figura 3); para el caso de los ant�genos� del extracto som�tico total evidenci� que muchos de estos reaccionan con� los� sueros heter�logos positivos a diferentes parasitosis (Fasciola hep�tica, y los g�neros Oesophagostomum, Trichostrongylus, Cooperia y Haemonchus); puesto que se observaron diferentes bandas� en el rango de 31-114 kD, por lo que existen anticuerpos en estos sueros� que reaccionan con los ant�genos� D. viviparus. Esto demuestra que los ant�genos de este par�sito en nuestras condiciones tambi�n poseen reactividad cruzada con los de estas parasitosis. Es por eso que cuando existe el mosaico antig�nico completo en un extracto, en su evaluaci�n diagn�stica se tiene en cuenta que la presencia de las reacciones cruzadas disminuye la especificidad de cualquier ensayo inmunol�gico (Barbaru y col., 2015). Otros autores (Britton y col., 2002), reportan reacciones cruzadas de extractos som�ticos totales fundamentalmente con Fasciola hepatica, Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophora, Ascaris suum, resultados que en algunos casos coinciden con los nuestros y demuestran que las reacciones cruzadas suelen ser m�s o menos acentuadas en dependencia del extracto proteico elaborado.

 

Figura 3: Evaluaci�n de la reactividad cruzada con el Western Blot. Sueros heter�logos, a � suero positivo a Fasciola hep�tica, y el g�nero Oesophagostomum, b- suero positivo a los g�neros Trichostrongylus, Cooperia y Haemonchus. 1 -Ant�genos som�ticos totales. 2- Ant�genos som�ticos purificados. 3- Ant�genos de excreci�n- secreci�n.

 

Con vistas a obtener ant�genos espec�ficos se han purificado los som�ticos (Kim y col., 2019). Se reporta por ellos fundamentalmente en los trabajos previos realizados el aislamiento por cromatograf�a de afinidad de fracciones antig�nicas con masas moleculares peque�as 17-18 kD, que han mostrado su utilidad en ensayos de detecci�n de anticuerpos (McCarthy y col., 2019). En el an�lisis de nuestro resultados existen bandas para todos los extractos analizados con masa molar 17-29 kD, donde los ant�genos no reaccionan con los sueros heter�logos empleados, estos resultados coinciden en parte con otros autores (Springer y col., 2021), porque ellos realizan una purificaci�n dirigida a una prote�na (17-18 kd) en espec�fico incluyendo una mayor cantidad de procedimientos, por lo que no tienen en cuenta los dos restantes polip�ptidos (24 y 29 kD) que identificamos y que tambi�n identifican en sus estudios otros autores ( Umair� y col., 2021)

 

Conclusiones

En todos los extractos proteicos preparados, se identificaron prote�nas antig�nicas de D.viviparus.

Los componentes antig�nicos del extracto som�tico total (AST) y de los productos de excreci�n-secreci�n, originaron reacciones cruzadas con los sueros de animales parasitados con Fasciola hepatica, los g�neros Oesophagostomum, Trichostrongylus, Cooperia y Haemonchus.

Los componentes antig�nicos del extracto som�tico purificado (AYM-30) de peso molecular (17, 24, 29 kD) resultaron ser espec�ficos de D. viviparus, por lo que son los responsables de la especificidad que muestra el ELISA de captura de ant�genos desarrollado utilizando un anticuerpo policlonal contra estos ant�genos.

 

Agradecimientos

Agradecemos la colaboraci�n y apoyo brindado por instituciones cient�ficas: Escuela Superior Politecnica de Chimborazo.� Sede Orellana, Universidad Aut�noma de M�xico, y la Universidad de Las Tunas. A los colegas de las Direcciones de Instituto de Medicina Veterinaria, por su colaboraci�n a trav�s de los Laboratorios Diagn�stico de Parasitolog�a y Empresas Pecuarias.

 

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