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Evaluaci�n comparativa del efecto inhibitorio de aceites esenciales extra�dos de la naranja (Citrus sinensis) en diferentes etapas de madurez sobre Lasiodiplodia theobromae bajo condiciones in vitro

 

Comparative evaluation of the inhibitory effect of essential oils extracted from orange (Citrus sinensis) at different stages of maturity on Lasiodiplodia theobromae under in vitro conditions

 

Avalia��o comparativa do efeito inibit�rio de �leos essenciais extra�dos de laranja (Citrus sinensis) em diferentes estados de matura��o sobre Lasiodiplodia theobromae em condi��es in vitro

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Correspondencia: ediazc2@uteq.edu.ec �

 

Ciencias T�cnicas y Aplicadas

Art�culo de Investigaci�n

 

 

* Recibido: 11 de julio de 2025 *Aceptado: 14 de agosto de 2025 * Publicado: �12 de septiembre de 2025

 

        I.            Universidad T�cnica Estatal de Quevedo, Quevedo, Los R�os, Ecuador.

      II.            Universidad T�cnica Estatal de Quevedo, Quevedo, Los R�os, Ecuador.

   III.            Universidad T�cnica Estatal de Quevedo, Quevedo, Los R�os, Ecuador.

   IV.            Universidad T�cnica Estatal de Quevedo, Quevedo, Los R�os, Ecuador.

Resumen

El presente trabajo forma parte del proyecto investigativo de la Universidad T�cnica Estatal de Quevedo �Extracci�n del aceite esencial de lim�n (Citrus lim�n) y naranja (Citrus sinensis) con potencial efecto inhibitorio en hongos que afectan la calidad del cacao y chocolate�. El estudio tuvo como prop�sito evaluar de manera comparativa el efecto inhibitorio de aceites esenciales extra�dos de c�scara de naranja (Citrus sinensis) en dos etapas de madurez (inmadura y madura) sobre el crecimiento de Lasiodiplodia theobromae bajo condiciones in vitro. Los aceites esenciales se obtuvieron mediante destilaci�n por arrastre de vapor a partir de c�scaras recolectadas en Quevedo (Los R�os, Ecuador) en dos estados de madurez (inmadura y madura). Posteriormente, se caracteriz� su composici�n qu�mica mediante cromatograf�a de gases acoplada a espectrometr�a de masas (GC-MS). El dise�o experimental se bas� en un esquema factorial (2 � 4), considerando dos niveles de madurez (E1: inmadura y E2: madura) y cuatro concentraciones del aceite (0 %, 50 %, 75 % y 100 %), con tres repeticiones por tratamiento. Las variables analizadas fueron rendimiento de aceite esencial, di�metro del micelio, crecimiento micelial e inhibici�n del crecimiento micelial. La caracterizaci�n qu�mica mostr� que el aceite de frutos inmaduros estuvo dominado por d-limoneno (79,7 %) y linalool (7,4 %), mientras que en frutos maduros se redujo la fracci�n de hidrocarburos (limoneno 38,6 %) y se incrementaron los compuestos oxigenados, destacando el linalool (29,3 %). El rendimiento de aceite fue significativamente mayor en frutos inmaduros (2,21 mL; 0,76 %) que en maduros (1,81 mL; 0,65 %). En las evaluaciones de crecimiento micelial, el factor estado de madurez no mostr� efectos significativos (p > 0,05). En contraste, el factor concentraci�n s� present� diferencias altamente significativas, con la mayor inhibici�n en el tratamiento al 100 %. Los valores de inhibici�n fueron de 100 % a 24 h, 83,96 % a 48 h y 41,75 % a 72 h para la concentraci�n m�xima. El efecto antif�ngico del aceite esencial dependi� principalmente de la concentraci�n aplicada, sin diferencias atribuibles al estado de madurez y las formulaciones concentradas mostraron un alto potencial para reducir el crecimiento de L. theobromae in vitro.

Palabras clave: Inhibici�n; aceite esencial; fitopat�genos; in vitro.

 

Abstract

This work is part of the research project of the Technical State University of Quevedo "Extraction of essential oil from lemon (Citrus limon) and orange (Citrus sinensis) with potential inhibitory effect on fungi that affect the quality of cocoa and chocolate." The study aimed to comparatively evaluate the inhibitory effect of essential oils extracted from orange peel (Citrus sinensis) at two stages of maturity (immature and ripe) on the growth of Lasiodiplodia theobromae under in vitro conditions. The essential oils were obtained by steam distillation from peels collected in Quevedo (Los R�os, Ecuador) at two stages of maturity (immature and ripe). Subsequently, their chemical composition was characterized by gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS). The experimental design was based on a factorial scheme (2 � 4), considering two maturity levels (E1: unripe and E2: ripe) and four oil concentrations (0%, 50%, 75% and 100%), with three replications per treatment. The variables analyzed were essential oil yield, mycelial diameter, mycelial growth and mycelial growth inhibition. Chemical characterization showed that the oil from unripe fruits was dominated by d-limonene (79.7%) and linalool (7.4%), while in ripe fruits the hydrocarbon fraction was reduced (limonene 38.6%) and oxygenated compounds increased, highlighting linalool (29.3%). The oil yield was significantly higher in unripe fruits (2.21 mL; 0.76%) than in ripe fruits (1.81 mL; 0.65%). In the mycelial growth evaluations, the maturity stage factor showed no significant effects (p > 0.05). In contrast, the concentration factor did present highly significant differences, with the greatest inhibition in the 100% treatment. Inhibition values ​​were 100% at 24 h, 83.96% at 48 h, and 41.75% at 72 h for the maximum concentration. The antifungal effect of the essential oil depended mainly on the applied concentration, with no differences attributable to the maturity stage. Concentrated formulations showed a high potential to reduce the growth of L. theobromae in vitro.

Keywords: Inhibition; essential oil; phytopathogens; in vitro.

 

Resumo

Este trabalho insere-se no projeto de investiga��o da Universidade T�cnica Estadual de Quevedo "Extra��o de �leo essencial de lim�o (Citrus limon) e laranja (Citrus sinensis) com potencial efeito inibit�rio sobre fungos que afetam a qualidade do cacau e do chocolate". O objetivo do estudo foi avaliar comparativamente o efeito inibit�rio de �leos essenciais extra�dos da casca de laranja (Citrus sinensis) em dois estados de matura��o (imaturo e maduro) no crescimento de Lasiodiplodia theobromae em condi��es in vitro. Os �leos essenciais foram obtidos por destila��o a vapor de cascas recolhidas em Quevedo (Los R�os, Equador) em dois estados de matura��o (imaturo e maduro). Posteriormente, a sua composi��o qu�mica foi caracterizada por cromatografia gasosa acoplada � espectrometria de massas (CG-EM). O desenho experimental baseou-se num esquema fatorial (2 � 4), considerando dois n�veis de matura��o (E1: imaturo e E2: maduro) e quatro concentra��es de �leo (0%, 50%, 75% e 100%), com tr�s repeti��es por tratamento. As vari�veis ​​analisadas foram o rendimento em �leo essencial, o di�metro micelial, o crescimento micelial e a inibi��o do crescimento micelial. A caracteriza��o qu�mica mostrou que o �leo dos frutos imaturos foi dominado pelo d-limoneno (79,7%) e pelo linalol (7,4%), enquanto nos frutos maduros a frac��o hidrocarboneto foi reduzida (limoneno 38,6%) e os compostos oxigenados aumentaram, destacando-se o linalol (29,3%). O rendimento em �leo foi significativamente maior nos frutos imaturos (2,21 mL; 0,76%) do que nos frutos maduros (1,81 mL; 0,65%). Nas avalia��es do crescimento micelial, o fator est�dio de matura��o n�o apresentou efeitos significativos (p > 0,05). Em contraste, o fator concentra��o apresentou diferen�as altamente significativas, sendo a maior inibi��o no tratamento de 100%. Os valores de inibi��o foram de 100% �s 24 h, 83,96% �s 48 h e 41,75% �s 72 h para a concentra��o m�xima. O efeito antif�ngico do �leo essencial dependeu principalmente da concentra��o aplicada, n�o havendo diferen�as atribu�veis ao estado de matura��o. As formula��es concentradas demonstraram um elevado potencial para reduzir o crescimento de L. theobromae in vitro.

Palavras-chave: Inibi��o; �leo essencial; fitopat�genos; in vitro.

 

Introducci�n

La creciente preocupaci�n por el impacto ambiental y sanitario del uso excesivo de pesticidas qu�micos en la agricultura ha motivado la b�squeda de alternativas m�s sostenibles para el control de fitopat�genos (Moreta et al., 2025). En este contexto, los aceites esenciales han emergido como compuestos bioactivos naturales con propiedades antimicrobianas, antif�ngicas y antioxidantes, lo que los posiciona como candidatos prometedores para el manejo integrado de plagas y enfermedades agr�colas (Mar�n et al., 2025). Estos compuestos, derivados de diversas estructuras vegetales como flores, hojas y c�scaras, han sido ampliamente estudiados por su eficacia contra microorganismos pat�genos que afectan la producci�n y la calidad de los cultivos (Graf & Stappen, 2022).

Entre los aceites esenciales de mayor inter�s se encuentra el aceite de naranja (Citrus sinensis), caracterizado por su alto contenido de limoneno, un monoterpeno con comprobada actividad biol�gica (Siddiqui et al., 2022). Diversos estudios han demostrado que el aceite de naranja posee propiedades antif�ngicas, antibacterianas y antioxidantes, lo cual le confiere una amplia aplicabilidad tanto en la industria alimentaria como en la fitosanitaria (Palacios et al., 2025). Sin embargo, uno de los factores determinantes en su actividad antimicrobiana es la etapa de madurez del fruto del cual se extrae, ya que esta influye directamente en la concentraci�n y composici�n de los compuestos vol�tiles presentes en el aceite (Ricardo et al., 2024). En particular, el limoneno puede representar entre el 85 % y el 95 % del aceite esencial de naranja, acompa�ado por otros monoterpenos como el mirceno y el α-pineno, as� como compuestos oxigenados como el linalool y el geraniol, que potencian sus efectos biol�gicos (Dehghan et al., 2020).

Uno de los pat�genos de mayor importancia en cultivos tropicales y subtropicales es Lasiodiplodia theobromae, un hongo perteneciente a la familia Botryosphaeriaceae, ampliamente distribuido y con un rango hospedero que incluye especies de alto valor comercial como el cacao, mango, aguacate, c�tricos, y papaya (Yang et al., 2019). Este fitopat�geno causa diversos s�ntomas, entre ellos la muerte regresiva de ramas, pudrici�n de frutos, necrosis y tiz�n foliar, lo que reduce dr�sticamente la calidad y el rendimiento de los cultivos afectados (Berraf et al., 2020), con su capacidad de persistir en restos vegetales y su amplio rango de hospederos lo convierten en una amenaza dif�cil de erradicar, especialmente en condiciones clim�ticas favorables.

Tradicionalmente, el control de L. theobromae se ha basado en la aplicaci�n de fungicidas sint�ticos, pero su uso intensivo ha generado resistencia en las poblaciones del hongo, as� como efectos negativos sobre la biodiversidad, los suelos y la salud humana (Moreira et al., 2021). Frente a esta problem�tica, el uso de aceites esenciales como el de naranja aparece como una alternativa viable y menos nociva, ya que se ha demostrado que el limoneno puede alterar la integridad de la membrana celular de hongos y bacterias, interferir en su metabolismo y estimular respuestas de defensa en las plantas (Li et al., 2018).

El objetivo del presente estudio fue evaluar comparativamente el efecto inhibitorio del aceite esencial extra�do de la c�scara de naranja (Citrus sinensis) en dos etapas de madurez (inmadura y madura) sobre el hongo Lasiodiplodia theobromae bajo condiciones in vitro, con la finalidad de determinar si el grado de madurez del fruto influye en la actividad antif�ngica del aceite. Para ello, se analiz� la composici�n qu�mica del aceite mediante cromatograf�a de gases (GC-MS), se cuantific� el rendimiento de extracci�n y se midi� la inhibici�n del crecimiento micelial del hongo, estableciendo relaciones entre las concentraciones evaluadas, el tiempo de exposici�n y el estado de madurez.

 

Metodolog�a

Se aplic� un dise�o experimental bifactorial A*B con ANOVA, seguido de una prueba de Tukey para evaluar las diferencias entre los promedios. El factor A, fue el estado de madurez con dos niveles (naranja inmadura y naranja madura); el factor B que se refiri� a la concentraci�n del aceite esencial (0, 50, 75 y 100 %), generando ocho tratamientos por triplicado, dando un total de 24 unidades experimentales (Tabla 1).

 

Tabla 1. Factores de estudio

 

Esto dio lugar a un total de ocho tratamientos, cada uno con tres repeticiones, lo que result� en 24 unidades experimentales en total (Tabla 2). La informaci�n recopilada fue analizada utilizando los softwares estad�sticos Statgraphics e Infostat.

 

Tabla 2. Descripci�n de los tratamientos

 

Preparaci�n del aceite esencial

La obtenci�n del aceite esencial se llev� a cabo mediante destilaci�n por arrastre de vapor a partir de la c�scara de frutos de Citrus sinensis recolectados en dos fases de madurez, inmadura y madura, provenientes de cultivos locales en Quevedo, provincia de Los R�os, Ecuador. Los frutos fueron seleccionados seg�n su estado de madurez, lavados cuidadosamente con agua potable para eliminar impurezas superficiales y posteriormente pelados con utensilios previamente esterilizados. Las c�scaras se sometieron a un proceso de destilaci�n por arrastre de vapor, siguiendo las recomendaciones metodol�gicas descritas por Briones & Guerrero (2019). El aceite obtenido se almacen� en frascos de vidrio �mbar y se conserv� a 4 �C hasta su empleo en las pruebas experimentales.

Los aceites esenciales extra�dos fueron caracterizados qu�micamente mediante cromatograf�a de gases (CG) con el prop�sito de identificar y cuantificar los compuestos mayoritarios, particularmente limoneno, cineol y linalol. Para el an�lisis, se prepararon diluciones de cada muestra (1:100) en solventes de grado anal�tico como hexano o metanol. Las soluciones se filtraron utilizando membranas de 0,45 μm antes de la inyecci�n. Los an�lisis se realizaron en un cromat�grafo de gases equipado con detector de ionizaci�n de llama o acoplado a espectrometr�a de masas, empleando una columna capilar dise�ada para la separaci�n de terpenos. Las condiciones cromatogr�ficas incluyeron: temperatura del inyector a 250 �C, detector a 280 �C, y un programa de horno que comenz� a 60 �C (2 min), seguido de un incremento de 4 �C por minuto hasta 240 �C, manteni�ndose por 5 minutos. Se utiliz� helio como gas portador con un flujo constante de 1 mL/min, inyectando 1 μL de muestra en modo split (1:50) seg�n Distefano et al. (2022).

La identificaci�n de los compuestos se efectu� a partir del c�lculo de �ndices de retenci�n de Kovats, empleando como referencia una mezcla de n-alcanos (C8�C20), y la comparaci�n de dichos �ndices y espectros de masas con bibliotecas estandarizadas (NIST y Wiley) y con informaci�n publicada en la literatura cient�fica. La cuantificaci�n se bas� en el m�todo de normalizaci�n de �reas. Finalmente, los cromatogramas obtenidos permitieron comparar la composici�n qu�mica de los aceites esenciales provenientes de frutos inmaduros y maduros, prestando especial atenci�n a las variaciones en el contenido de limoneno, cineol y linalol (Urrunaga et al., 2022).

 

 

Preparaci�n del medio de cultivo y del hongo

El medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) se prepar� conforme a las especificaciones del fabricante y se esteriliz� en autoclave a 121 �C durante 15 minutos. Posteriormente, el medio se distribuy� en placas Petri est�riles y se dej� solidificar a temperatura ambiente. Sobre estas placas se realiz� la siembra del hongo, incub�ndolo a 28 �C durante un periodo de 7 d�as. Durante la incubaci�n se llev� a cabo el seguimiento del desarrollo del micelio y de la formaci�n de picnidios caracter�sticos de la especie (Farahmandfar et al., 2020).

Variables evaluadas

1. Caracterizaci�n cromatogr�fica del aceite esencial: Para el an�lisis de los componentes presentes en el aceite esencial extra�do de la c�scara de naranja en los dos estados de madurez evaluados, se tomaron al�cuotas de 10 mL por cada tipo de muestra y se remitieron al Laboratorio de Qu�mica Anal�tica de la Universidad T�cnica Particular de Loja (UTPL) para su caracterizaci�n.

2. Cuantificaci�n del aceite esencial obtenido: El rendimiento del aceite esencial, expresado en mililitros, se determin� registrando el volumen total extra�do a partir de 300 g de c�scara de fruta en cada estado de madurez. A partir de estos valores se calcul� el promedio correspondiente para cada etapa de madurez.

3. Medici�n del di�metro del micelio (mm): El crecimiento micelial de Lasiodiplodia theobromae se evalu� midiendo el di�metro de las colonias con un calibrador digital. En cada placa Petri se realizaron dos mediciones perpendiculares y se promedi� el resultado. Estas mediciones se llevaron a cabo cada 24 horas durante tres d�as consecutivos. Los resultados de cada tratamiento se expresaron en mil�metros, siguiendo el procedimiento propuesto por Oliveira-Da Silva et al. (2017).

4. Crecimiento micelial: El crecimiento micelial experimentado por el hongo entre la primera y la �ltima evaluaci�n, se estableci� mediante la diferencia entre el di�metro micelial registrado en �stas, aplicando la siguiente f�rmula:

D�nde:

CM: Crecimiento micelial (mm)

DMf: Di�metro micelial en la evaluaci�n final (mm)

DMi: Di�metro micelial en la evaluaci�n inicial (mm)

5. Inhibici�n del crecimiento micelial: Con base a los valores del di�metro micelial registrado en cada una de las tres evaluaciones, se determin� la inhibici�n del crecimiento micelial (ICM), utilizando la f�rmula descrita por Araya et al. (2019).

D�nde:

ICM: Inhibici�n del crecimiento micelial (%)

DMC: Di�metro del micelio en el tratamiento control (mm)

DMT: Di�metro del micelio en el tratamiento (mm)

 

Resultados

Composici�n cromatogr�fica de aceites esenciales de c�scara de naranja Valencia

Las muestras de aceite esencial obtenidas de la c�scara de naranja variedad Valencia (Citrus sinensis) en los estados inmaduro (CIM) y maduro (CM) fueron analizadas mediante cromatograf�a de gases acoplada a espectrometr�a de masas (GC-MS) con el prop�sito de caracterizar su perfil de compuestos vol�tiles. Los cromatogramas generados para cada tratamiento se presentan en la Figura 2A, correspondiente a la c�scara inmadura, y en la Figura 1 para la c�scara madura. Estos resultados evidenciaron diferencias notables en la abundancia relativa de los compuestos detectados entre ambos grados de madurez.

 

Figura 1. Cromatograma del aceite esencia de cascara de naranja inmadura y madura

Composici�n qu�mica del aceite esencial de c�scara inmadura

El an�lisis del aceite esencial obtenido de la c�scara de naranja Valencia en estado inmaduro (CIM), realizado mediante cromatograf�a de gases acoplada a espectrometr�a de masas (GC-MS), mostr� un perfil qu�mico dominado por monoterpenos de tipo hidrocarburo. Dentro de estos compuestos destac� el d-limoneno, que alcanz� una proporci�n del 79,7 % y constituy� el componente principal responsable del aroma caracter�stico del aceite. Asimismo, se observ� una concentraci�n elevada de linalool (7,4 %), un monoterpeno oxigenado de aroma floral y conocido por su actividad biol�gica, cuyo valor supera el promedio reportado para aceites esenciales de naranja (< 3 %). Este incremento podr�a estar asociado a la t�cnica de extracci�n empleada, posiblemente la destilaci�n por arrastre de vapor, o a las condiciones fisiol�gicas del fruto en etapa inmadura, que favorecer�an la liberaci�n de alcoholes monoterp�nicos. Otros compuestos relevantes identificados fueron β-mirceno (2,2 %), octanal (2,0 %), α-terpineol (1,3 %), terpinen-4-ol (1,0 %), as� como los is�meros de citral (geranial, 0,96 % y neral, 0,68 %) y decanal (0,66 %). La presencia de aldeh�dos alif�ticos como el octanal y el decanal aporta notas arom�ticas c�tricas m�s intensas al aceite.

Composici�n qu�mica del aceite esencial de c�scara madura

El aceite esencial extra�do de la c�scara de naranja Valencia en estado maduro (CM) mostr� un perfil qu�mico claramente diferenciado respecto al observado en la fase inmadura (CIM), lo que evidencia modificaciones asociadas al proceso de maduraci�n del fruto y/o a las condiciones de extracci�n. Aunque el d-limoneno continu� siendo el compuesto mayoritario, su proporci�n disminuy� de forma notable hasta un 38,6 %, reflejando una marcada reducci�n en la fracci�n hidrocarbonada y una transici�n hacia compuestos m�s oxigenados. En esta etapa, el linalool destac� como el segundo componente m�s abundante, alcanzando un 29,3 %, un valor muy superior al reportado habitualmente (< 5 %). Este incremento apunta a un proceso de oxidaci�n del limoneno o a la liberaci�n de metabolitos oxigenados previamente ligados a la matriz vegetal. Otros monoterpenos oxigenados de relevancia en esta muestra fueron el α-terpineol (4,5 %), geranial (1,75 %), neral (1,53 %) y geraniol (1,38 %), todos asociados con funciones de defensa en plantas y con potencial uso en aplicaciones terap�uticas.

Los aldeh�dos alif�ticos como decanal (2,04 %), octanal (1,69 %) y nonanal (0,78 %) se encontraron en mayores concentraciones en comparaci�n con el aceite de frutos inmaduros, lo que indica una actividad oxidativa m�s intensa sobre las cadenas terp�nicas. De forma similar, la presencia de terpinen-4-ol se elev� hasta 1,72 %, posiblemente como resultado de procesos de oxidaci�n secundaria. A diferencia de lo observado en la fase inmadura, los monoterpenos hidrocarbonados minoritarios disminuyeron de manera general: β-mirceno (~ 0,9 %), α-pineno (~ 0,3 %) y sabineno (~ 0,16 %), mientras que otros se detectaron en proporciones inferiores al 0,1 %. Esta tendencia, junto con el incremento de compuestos oxigenados, refleja la conversi�n progresiva de hidrocarburos durante la maduraci�n.

Adem�s, en las muestras de frutos maduros se identificaron sesquiterpenos en niveles traza, como (E)-cariofileno (0,2 %), α-copaeno (0,06 %) y β-copaeno (0,04 %), compuestos ausentes en los aceites de frutos inmaduros. Su presencia podr�a relacionarse con la disminuci�n de la fracci�n de limoneno, que permiti� su detecci�n, o con una s�ntesis inducida por los cambios fisiol�gicos propios de la madurez avanzada.

En conjunto, el aceite esencial de frutos maduros present� una composici�n m�s diversificada y rica en compuestos oxigenados que la muestra inmadura, lo que ampl�a su potencial de uso en sectores terap�uticos, cosm�ticos y alimentarios. La identificaci�n de los compuestos vol�tiles se realiz� mediante la comparaci�n de los �ndices de retenci�n (RI), obtenidos a partir de una serie est�ndar de alcanos lineales (C9�C22), con valores reportados en bibliograf�a especializada.

 

Tabla 3. Componentes vol�tiles principales en c�scaras inmaduras y maduras

 

Cantidad de aceite esencial obtenido (mL)

La Figura 2 muestra los valores promedio de aceite esencial extra�do a partir de 300 g de c�scara de naranja en los dos estados de madurez evaluados. El an�lisis de varianza evidenci� diferencias altamente significativas entre tratamientos (p < 0,0001), con un coeficiente de variaci�n del 8,21 %. La cantidad de aceite esencial estuvo directamente influenciada por el grado de madurez del fruto. Las c�scaras provenientes de frutos inmaduros generaron un mayor volumen promedio (2,21 mL), equivalente a un rendimiento del 0,76 %, mientras que las c�scaras de frutos maduros produjeron 1,81 mL con un rendimiento del 0,65 %. Estas diferencias fueron estad�sticamente significativas.

 

Figura 2. Total, de aceite esencial obtenido de la c�scara de naranja en dos estados de madurez

 

Di�metro del micelio (mm)

Los valores promedio del di�metro del micelio de Lasiodiplodia theobromae medidos a las 24, 48 y 72 horas de incubaci�n, bajo la aplicaci�n de tres concentraciones de aceite esencial proveniente de c�scaras de naranja en dos estados de madurez, se resumen en la Tabla 4. El an�lisis de varianza indic� que el estado de madurez no present� diferencias significativas en ninguno de los tiempos evaluados (p = 0,2428; p = 0,2095; p = 0,2751 para 24, 48 y 72 h, respectivamente). Por el contrario, el factor concentraci�n mostr� diferencias altamente significativas a las 24 y 48 horas (p < 0,0001) y significativas a las 72 horas (p = 0,0185). La interacci�n entre factores solo fue significativa en la evaluaci�n de las 24 horas (p = 0,0073). Los coeficientes de variaci�n estuvieron entre 12,19 % y 22,92 %.

En cuanto al promedio general, los di�metros registrados para los tratamientos seg�n madurez fueron de 3,02 a 3,10 mm a las 24 h, 16,81 a 19,97 mm a las 48 h y 33,93 a 37,38 mm a las 72 h. La comparaci�n entre concentraciones mostr� mayores valores en el control (C0: 0 %), con 7,92; 31,21 y 41,00 mm a las 24, 48 y 72 h, respectivamente. A las 24 h, C0 present� diferencias significativas frente a las dem�s concentraciones, cuyos promedios se mantuvieron entre 0,00 y 3,58 mm. En la evaluaci�n a las 48 h, C0 (31,21 mm) no difiri� de C1: 50 % (21,42 mm), pero s� super� a C2: 75 % (16,14 mm) y C3: 100 % (4,79 mm). A las 72 h, C0 fue similar a C1 (39,17 mm) y C2 (38,75 mm), y mayor que C3 (23,71 mm). En las interacciones, a las 24 h, E1C0 y E2C0 registraron los valores m�s altos (8,17 y 7,67 mm), sin diferencias entre ellos y superando al resto. En este periodo no hubo crecimiento en E1C2, E1C3 y E2C3. A las 48 h, E1C0 alcanz� 32,67 mm, siendo estad�sticamente superior a los tratamientos con 75 % y 100 %. En la evaluaci�n de 72 h no se observaron diferencias significativas entre interacciones, con promedios entre 18,42 mm y 41,43 mm.

 

Tabla 4. Di�metro del micelio de L. theobromae durante 72 horas de incubaci�n en respuesta a la aplicaci�n de tres concentraciones de aceite esencial obtenidos de dos estados de madurez

 

Crecimiento micelial

En la Tabla 5 se muestran los valores promedio correspondientes al crecimiento micelial y a la tasa de crecimiento de Lasiodiplodia theobromae durante un per�odo de 72 horas de incubaci�n bajo la aplicaci�n de tres concentraciones de aceite esencial obtenido de c�scaras de naranja en dos estados de madurez. El an�lisis de varianza indic� que ninguna de las fuentes de variaci�n evaluadas present� significancia estad�stica tanto para el crecimiento micelial como para la tasa de crecimiento (p > 0,05), registr�ndose coeficientes de variaci�n de 18,54 % y 16,84 %, respectivamente.

En relaci�n con el factor estado de madurez, no se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos, observ�ndose promedios de crecimiento micelial que oscilaron entre 30,92 mm y 34,28 mm y tasas de crecimiento en el rango de 10,31 a 11,43 mm d�a⁻�. De manera similar, para el factor concentraci�n, los resultados no evidenciaron diferencias significativas entre los niveles evaluados, con valores de crecimiento micelial entre 23,71 mm y 38,00 mm y tasas de crecimiento comprendidas entre 7,90 y 12,67 mm d�a⁻�. Las interacciones entre ambos factores tampoco mostraron efectos significativos, con promedios de crecimiento micelial que variaron entre 18,42 mm y 38,33 mm, y tasas de crecimiento que fluctuaron entre 6,14 y 12,78 mm d�a⁻�.

 

Tabla 5. Crecimiento micelial y tasa de crecimiento de L. theobromae durante 72 horas de incubaci�n en respuesta a la aplicaci�n de tres concentraciones de aceite esencial

 

Inhibici�n del crecimiento micelial

En la Tabla 6 se presentan los valores promedio de la inhibici�n del crecimiento micelial de Lasiodiplodia theobromae obtenidos a las 24, 48 y 72 horas de incubaci�n, tras la aplicaci�n de tres concentraciones de aceite esencial extra�do de c�scaras de naranja en dos estados de madurez. El an�lisis de varianza mostr� que ni el estado de madurez ni la interacci�n entre factores alcanzaron significancia estad�stica (p > 0,05), mientras que el efecto de las concentraciones fue altamente significativo en las tres mediciones (p < 0,01). Los coeficientes de variaci�n oscilaron entre 11,19 % y 70,01 %.

En las tres evaluaciones, los valores promedio de inhibici�n no difirieron entre los estados de madurez. Para frutos inmaduros (E1) se obtuvieron porcentajes de 63,03 %, 48,60 % y 16,11 % a las 24, 48 y 72 horas, respectivamente, mientras que para frutos maduros (E2) los valores fueron 58,96 %, 31,97 % y 9,70 % en los mismos tiempos.

En cuanto al factor concentraci�n, a las 24 horas la inhibici�n fue completa en C3: 100 % (100,00 %), sin diferencias significativas frente a C2: 75 % (89,95 %), y superior a C1: 50 % (54,03 %) y C0: 0 % (0,00 %). A las 48 horas, la mayor inhibici�n correspondi� a C3: 100 % (83,96 %), sin diferencia respecto a C2: 75 % (46,64 %), y con valores superiores a C1: 50 % (30,55 %) y C0: 0 %. En la evaluaci�n de 72 horas, C3: 100 % present� 41,75 % de inhibici�n, superando significativamente al resto de concentraciones (0,00�5,44 %).

En las interacciones, a las 24 horas se registr� inhibici�n total en E1C2, E1C3 y E2C3 (100,00 %), sin diferencia con E2C2 (79,89 %). A las 48 horas, E1C3 alcanz� 91,55 %, sin diferencias con interacciones que presentaron valores entre 22,61 % y 70,66 %. Para las 72 horas, E1C3 mantuvo el valor m�s alto (53,77 %), diferenci�ndose �nicamente de E1C0 y E2C0, que no mostraron inhibici�n (0,00 %).

 

Tabla 6. Inhibici�n del crecimiento micelial de L. theobromae durante 72 horas de incubaci�n en respuesta a la aplicaci�n de tres concentraciones de aceite esencial

 

Discusi�n

El an�lisis de la fracci�n vol�til de los aceites esenciales mostr� que el d-limoneno fue el compuesto predominante en la c�scara inmadura (CIM), con un 79,7 % del total, este hallazgo coincide con lo indicado por El Hachlafi et al. (2024), quienes se�alan que el limoneno representa entre el 70 % y 90 % del aceite esencial de Citrus sinensis, dependiendo del m�todo de extracci�n. En la c�scara madura (CM) se observ� una disminuci�n notable de este monoterpeno hasta el 38,6 %, fen�meno que podr�a estar relacionado con transformaciones qu�micas producidas durante la maduraci�n y la hidrodestilaci�n. Esta reducci�n estuvo acompa�ada por un incremento de compuestos oxigenados, especialmente linalool (29,3 %), α-terpineol (4,5 %), geraniol (1,38 %) y aldeh�dos como geranial, neral y decanal. De acuerdo con Njoroge et al. (2005), el linalool raramente supera el 5 % cuando se emplea extracci�n en fr�o, lo que sugiere que la hidrodestilaci�n y los cambios bioqu�micos durante la maduraci�n favorecen la conversi�n del limoneno en alcoholes y aldeh�dos.

Estas variaciones en la composici�n qu�mica est�n relacionadas con la actividad enzim�tica y metab�lica que ocurre durante la maduraci�n, generando aromas suaves y florales (Gonz�lez et al., 2020). En etapas previas, el limoneno tiene un papel protector frente a plagas por su mayor concentraci�n, asimismo, el mayor rendimiento de aceite en la c�scara inmadura puede atribuirse a la mayor acumulaci�n de metabolitos en frutos verdes (Bunse et al., 2022), mientras que en la madurez parte de estos compuestos se transforman o se volatilizan (C�rdova et al., 2020). Estudios confirman esta tendencia en c�tricos y otras frutas (Gonz�lez & V�liz, 2020; Distefano et al., 2022).

Los resultados indican que no se encontraron diferencias significativas en el di�metro del micelio de L. theobromae entre los aceites esenciales obtenidos de c�scaras inmaduras y maduras, lo que sugiere que la presencia y concentraci�n de compuestos con actividad antif�ngica son comparables en ambas etapas. Este comportamiento coincide con lo descrito por Jim�nez et al. (2022), quienes se�alan que, aunque el perfil qu�mico de los aceites c�tricos puede variar durante la maduraci�n, la actividad antif�ngica se mantiene si los metabolitos activos principalmente monoterpenos y fenilpropanoides. En cambio, las diferencias se observaron entre concentraciones, evidenciando que la eficacia del aceite depende de la dosis aplicada, de forma similar, Palacios et al. (2025) documentaron que la inhibici�n del crecimiento micelial de hongos fitopat�genos aumenta proporcionalmente con la concentraci�n de aceites ricos en limoneno y linalool, lo que indica un efecto dosis dependiente asociado a la alteraci�n de la membrana celular y el metabolismo del pat�geno.

La mayor reducci�n del crecimiento micelial se registr� en las concentraciones m�s altas, sin diferencias atribuibles al estado de madurez, lo que concuerda con Camargo et al. (2019), quienes demostraron que el tiempo de exposici�n a compuestos activos intensifica los efectos antif�ngicos. La ausencia de diferencias en las �ltimas evaluaciones sugiere una posible adaptaci�n del hongo o disminuci�n de la eficacia con el tiempo y aunque se observ� una tendencia a una menor tasa de crecimiento conforme aument� la concentraci�n del aceite, estas diferencias no fueron estad�sticamente significativas. Seg�n G�mez et al. (2019), a bajas concentraciones los aceites esenciales ejercen efectos fungist�ticos y, a concentraciones m�s altas, efectos fungicidas; sin embargo, en este estudio, la volatilidad del aceite o la tolerancia del hongo podr�an explicar la falta de significancia.

No se detectaron diferencias significativas en la inhibici�n del crecimiento micelial de L. theobromae entre los aceites esenciales obtenidos de c�scaras en los dos estados de madurez, lo que indica que las variaciones en la composici�n qu�mica no fueron suficientes para producir cambios marcados en su efecto antif�ngico. Aunque diversos estudios se�alan que la madurez de los frutos puede alterar la concentraci�n de metabolitos bioactivos, en este caso parece mantenerse estable la presencia de compuestos secundarios con acci�n antif�ngica en ambos estados. No obstante, la inhibici�n ligeramente superior registrada con el aceite de naranja inmadura podr�a relacionarse con una mayor concentraci�n de limoneno y otros terpenos caracter�sticos de los frutos en desarrollo, como se�alan Melkina et al. (2021).

En contraste, las concentraciones evaluadas s� mostraron diferencias estad�sticamente significativas, evidenciando un efecto dependiente de la dosis, en el que la inhibici�n del crecimiento se intensifica a medida que aumenta la cantidad de aceite. La disminuci�n de la eficacia a las 72 horas podr�a estar asociada a la volatilizaci�n de compuestos activos o a la capacidad de adaptaci�n del hongo ante una exposici�n prolongada (Palacios et al., 2025).

Estos hallazgos son consistentes con estudios, como los de Stegmayer et al. (2021), quienes reportan que la actividad antif�ngica de aceites esenciales c�tricos puede ser limitada en concentraciones bajas y que su efectividad depende de m�ltiples factores, como el tipo de pat�geno, la matriz vegetal y las condiciones ambientales. Por lo tanto, se hace evidente la necesidad de profundizar en la caracterizaci�n del aceite de naranja en distintos estados de madurez y su efecto espec�fico sobre pat�genos de importancia agr�cola.

 

Conclusiones

Se demostr� que la composici�n qu�mica de los aceites esenciales de Citrus sinensis var�a significativamente con el estado de madurez, con un predominio de d-limoneno en frutos inmaduros y una mayor proporci�n de compuestos oxigenados en frutos maduros. Sin embargo, estas diferencias no se tradujeron en variaciones significativas en la inhibici�n del crecimiento de L. theobromae.

El rendimiento de extracci�n fue superior en frutos inmaduros, lo que los posiciona como una fuente m�s eficiente de aceite esencial. La actividad antif�ngica evidenci� una clara relaci�n dosis-respuesta: concentraciones del 75 % y 100 % lograron una inhibici�n marcada del crecimiento micelial durante las primeras 48 horas, mientras que concentraciones menores mostraron efectos reducidos. A las 72 horas, se observ� una disminuci�n en la eficacia del tratamiento, posiblemente asociada a la volatilizaci�n de compuestos activos o a mecanismos de tolerancia del hongo. Los aceites esenciales de naranja presentan un potencial prometedor como agentes antif�ngicos naturales en el manejo alternativo de enfermedades causadas por L. theobromae. Su aplicaci�n podr�a contribuir a reducir la dependencia de fungicidas sint�ticos, con beneficios ambientales y para la inocuidad de los alimentos.

Para futuros estudios, se recomienda investigar la optimizaci�n de formulaciones estables que mantengan la eficacia de los aceites esenciales a lo largo del tiempo, as� como realizar ensayos en condiciones de campo para validar los resultados obtenidos en laboratorio. Tambi�n es necesario evaluar la fitotoxicidad en cultivos comerciales y estudiar los mecanismos de acci�n de los compuestos bioactivos presentes en el aceite, con el fin de desarrollar estrategias integradas y sostenibles de control de pat�genos agr�colas.

 

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